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紫杉醇是一种从红豆杉树中发现的具有抗肿瘤作用的二萜类化合物,目前已广泛的在临床上应用于卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌症的治疗,且疗效明显。紫杉醇的生产方法主要有红豆杉栽培法、化学合成法、细胞培养法、微生物发酵法等。药源不足是长期以来制约紫杉醇在临床中广泛应用的瓶颈问题,也成为研究的热点。利用基因工程技术构建紫杉醇高产菌株有望在较短的时间内显著提高紫杉醇产量,然而目前有关产紫杉醇微生物的遗传背景尚不清楚,对于微生物合成紫杉醇的代谢途径及相关酶的研究也未见报导,因此对于微生物合成紫杉醇的代谢途径及相关酶的研究及阐明十分必要。本试验研究以从东北红豆杉中分离的产紫杉醇内生真菌选育获得的工程菌株HDF-68为出发菌株,根据GenBank中紫杉醇生物合成途径相关酶基因序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆菌株HDF-68生物合成紫杉醇的相关酶基因。结果表明,本试验成功克隆得到了 GGPP合成酶、紫杉二烯5α-羟化酶、紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶以及紫杉烷10β-羟化酶4种相关酶基因的cDNA全长;同时,通过Blast分析表明,得到的4种酶基因基因序列与GenBank中已经提交的相对应基因同源性达到99%-100%。将获得的酶基因片段双酶切后连接到具有相同双酶切位点的表达载体pET28a上,转化E.coli BL21(DE3)进行原核表达验证;用0.05mmol/LIPPTG诱导重组子进行表达培养,试验中研究了各自最佳诱导时间。SDS-PAGE电泳结果分析表明,克隆得到的酶基因片段中,GGPP合成酶基因、紫杉二烯5α-羟化酶基因以及紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶基因均在E.coli BL21(ED3)中实现了高效表达。试验中同时对重组菌株蛋白表达形式进行了分析,结果表明,GGPP合成酶基因、紫杉二烯5α-羟化酶基因表达出了可溶性蛋白;另外,本试验对表达蛋白的基本性质及结构进行了生物信息学预测,为后续的进一步研究奠定了理论基础。本试验还将克隆得到的3条基因全长连接到pBI121-43双元表达载体上,利用根癌农杆菌介导法将3种基因转化入原始出发菌株HDF-68中,在特殊平板培养基上进行初步筛选阳性转化子,提取基因组DNA进行PCR验证。将阳性转化子转入S-7发酵培养基中培养12d,对发酵液中紫杉醇进行回收纯化,利用TLC及HPLC法对紫杉醇进行定性及定量分析。本试验研究为进一步分离微生物紫杉醇生物合成途径相关基因以及构建产量大幅提高的紫杉醇基因工程菌株奠定了基础,同时,也为阐明微生物紫杉醇生物合成途径提供了理论依据。