【摘 要】
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a-葡萄糖苷酶（a-glucosidase, EC3.2.1.20）也称作0α-葡萄糖基转移酶,或者α-葡萄糖转苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-糖苷键从而释放出葡萄糖,也可以将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成a-糖苷键,在低聚异糖生产过程中起着关键作用。新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）是一种远古的耐热菌,它能产生多种耐热酶,如α-葡萄糖苷酶、木
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a-葡萄糖苷酶（a-glucosidase, EC3.2.1.20）也称作0α-葡萄糖基转移酶,或者α-葡萄糖转苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-糖苷键从而释放出葡萄糖,也可以将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成a-糖苷键,在低聚异糖生产过程中起着关键作用。新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）是一种远古的耐热菌,它能产生多种耐热酶,如α-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和纤维素酶等,这些酶在工业和食品业中具有广泛的应用前景。由于新阿波罗栖热袍菌需在厌氧高温环境中培养,生长条件苛刻,不易实现大量生产,本试验拟完成Thermotoga neapolitana DSM4359a-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达,为其扩大应用奠定基础。1. T.neapolitana DSM4359a-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达根据Gene Bank中已知的T.neapolitana DSM4359a-葡萄糖苷酶基因序列并结合表达载体pET32a （+）的特点,采用引物设计软件Primer5设计特异性引物。通过PCR方法从总DNA中扩增出预期的大小为1.4kb左右的特异性产物,进行TA克隆并测序。将目的基因片段和表达载体双酶切后用T4DNA连接酶连接并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中,获得重组子pET32a-tnag。该重组子用限制性内切酶BamH I/Xho I同时双酶切,水解得到两个片段,大小分别为5.9kb和1.4kb,与表达载体pE32a（+）和目的基因大小相符,初步证实α-葡萄糖苷酶的克隆是正确的。重组子经上海生工生物公司测序,所得序列与原序列比较完全一致,其开放阅读框大小为1443bp,编码480个氨基酸。将重组子pET32a-tnag转入宿主菌Rosseta中得到工程菌R-tnag,经过终浓度为0.8mmol/L的IPTG在30℃诱导表达6个h后,发酵液分泌蛋白SDS-PAGE呈现约80KDa的目的蛋白表达条带。2.重组α-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质研究大肠杆菌中表达的重组α-葡萄糖苷酶在羧基端上带有6xHis的标签,利用重组酶的耐热性,65℃热处理20min可以初步纯化重组酶,再进一步利用Ni-NTA亲和柱来纯化重组酶。经SDS-PAGE电泳显示,得到单一、清晰的纯酶条带。以pNPG为底物,研究纯酶的酶学性质,发现原核表达的重组α-葡萄糖苷酶最适温度为80℃,热稳定性较好；该酶最适pH为5,属酸性酶,在pH4-8的环境中具有很好的稳定性；金属离子Fe3+、Fe2+和螯合剂EDTA对酶活具有促进作用,Ag+和A13+有明显的抑制作用,蛋白变性剂SDS和Ca2+、Ni2+对酶活有轻微的抑制作用；在80℃、pH5的条件下,以pNPG作为底物,重组α-葡萄糖苷酶的Km为1.4387mmol/L, Vmax为2.0734mmol/L-min。
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