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本文利用一株校园土壤中筛选出具有偶氮染料酸性红14(Acid Red14-AR14)脱色能力的芽孢杆菌B1(Bacillus sp.,API鉴定),通过对其偶氮还原酶(Azoreductase-AZR)酶学性质的研究,探讨强磁场(High MasticEeld-HMF)对菌株B1的AZR脱色降解AR14特性的影响规律及其强化机理,实验主要内容如下:
对照菌株细胞与细胞各部分的AR14脱色实验,得到胞外粗酶液、细胞膜悬浮液24 h始终未显示出脱色活性,而胞内粗酶液能在3 h内完全脱色、且胞内粗酶液的脱色速率(单位时间内AR14摩尔浓度变化量)是菌株细胞的4.7倍的结果,表明芽孢杆菌B1的AZR定位于细胞质内。菌株B1的最佳产酶接种量为10%时,37℃、120 r/min培养24h;超声波破碎细胞的最佳条件为:功率250 W、工作10 s、间隙20 s、工作20次,总时间10 min;40~60%硫酸铵沉淀后所得酶为AZR的盐析纯酶。
菌株B1的AZR酶学特性的研究表明:以AR14为底物时,该酶的最适脱色反应温度和pH值分别为32℃和8.0,在最适区间之外,AZR的比酶活(每毫克蛋白质的酶活力,U/mg)大幅下降:AZR在40℃以下热稳定性良好,相对比酶活能保持65%以上,但50℃下保温2 h后相对比酶活仅为2.8%(以32℃的比酶活为100%);在pH值在5.0~9.0的区间内,AZR有较高的酸碱稳定性。菌株B1的AZR对AR14的脱色活性主要依赖NADH、而不是NADPH作为电子供体;大部分常见的金属离子都对酶活力表现出一定抑制作用,抑制顺序依次为Cu2+、Co2+、Fe3+、Fe2+、Mn2、Na+、Ba2+、Mg2+、K+和Ca2+;浓度为5.0mmol/L、10.0mmol/L和20.0mmol/L的EDTA能抑制部分酶活力;32℃、pH8.0、NADH浓度为1.00mmol/L时,AZR对AR14脱色反应的Km和Vmax值分别为3.99mmol/L和55.07μmol/L·min。
在不同强度(2 T、3 T和4 T的HMF中暴露20 mm)和不同暴露时间(10T的HMF中暴露40、60、240和720 min)的HMF处理后,对菌株的AZR酶学特性进行了考察,结果表明:磁处理菌株胞内粗酶的比酶活随磁场强度的增加而逐步提高,分别为初始菌株B1的3.69、4.61和4.92倍(2~4 T),而比酶活则随处理时间的增加呈现出峰型变化(10 T,40~720 min),当暴露时间为240 min时,比酶活达到最高值0.092 U/mg:HMF作用并未改变菌株AZR的最适反应温度和pH(32℃和8.0),但能有效减缓AZR在最适区外相对比酶活大幅下降的趋势(以最适条件下AZR的比酶活为100%):在相同条件下,4 T较2 T和3 T的HMF更能提高AZR抗EDTA抑制的能力;HMF作用改变了AZR对电子供体的利用能力,不仅使得处理菌株的AZR利用NADH的能力提高了4~8倍,而且使得AZR也具备了利用NADPH为电子供体的能力,同时,不同场强与暴露时间的处理,菌株的AZR利用NADH和NADPH的效率比值呈现一定差异(NADH:NADPH):1.26、2.73和2.25(2~4T),3.85、4.24、3.83和3.50(10T,40~720min):动力学的研究显示,HMF强化了处理菌株的AZR与染料底物之间的亲和能力,Km值由原菌株的3.99 mmol/L下降为1.46 mmol/L、0.90 mmol/L和0.58 mmol/L(2~4 T)。
对HMF强化菌株的AZR的脱色性能的机理的研究表明:HMF作用改变了处理菌株AZR酰胺带的FTIR吸收峰的峰形和生色氨基酸Trp、Tyr和Phe的含量,导致AZR的二级结构构象发生了改变;同时,HMF作用强化了磁处理菌株C3的AZR脱色活力,使其比酶活为初始菌株B1的1.44倍,但并未明显改变菌株AZR的分子量,因而表明HMF的强化作用可能主要在于改变了处理菌株AZR电子接受部位的特性。