柑橘粉虱(Diaelorude citri Asahmaed)是广泛存在于世界柑橘产区的重要害虫。由于其具有刺吸式口器，可以吸食柑橘汁液，为害严重后引起落叶落果;更为可怕的是，柑橘粉虱可分泌黏性蜜露，蜜露将空气中的灰尘吸附到叶片表面，并为一些霉菌提供营养物质，从而引发煤烟病，严重影响柑橘光合作用，造成减产。目前防治柑橘粉虱的主要方法是化学防治，但化学药剂施用不当往往导致农药残留、昆虫抗药性等一系列的问题。渐狭蜡蚧菌（子囊菌纲，肉座菌目，蜡蚧菌属）作为一种重要的昆虫病原真菌，它可以穿透粉虱体壁，消耗其营养，最终导致粉虱死亡，这为研制环保型微生物农药提供了可能。但是由于渐狭蜡蚧菌毒力弱，侵染周期长，还很难与化学农药竞争。本研究通过构建基于粉虱免疫基因的RNAi载体，将其转化进入蜡蚧菌，以期真菌侵染粉虱之际，释放dsRNA，对粉虱免疫基因实行干扰，减弱昆虫对病原真菌的免疫反应，从而实现毒力的增强。实施步骤如下:　　1.丝状真菌RNAi载体的构建　　以pBHt2质粒为模板，扩增PtrpC启动子和PtrpC+ HygR元件;以pAN7-1为模版，扩增TtrpC终止子;利用StuⅠ和XhoⅠ内切酶酶切掉pFGC5941的35S启动子，置换上PtrpC启动子，构建成PtrpC+ Intron结构;利用MssⅠ和SmaⅠ内切酶酶切掉pFGC5941的OCS终止子，置换上TtrpC终止子，构建成PtrpC+Intron+TtrpC结构;利用EcoRⅠ和PstⅠ内切酶酶切掉pFGC5941的MAS+BlpR元件，置换上PtrpC+ HygR元件。构建成PtrpC+ hygR+ PtrpC+ Intron+TtrpC结构。至此RNAi载体改造完成，并将改造后的载体命名为pRCy1。　　2.基于粉虱免疫基因RNAi载体的构建　　查找柑橘粉虱转录组数据库，找到参与粉虱免疫相关的酚氧化酶原基因(PPO)、酚氧化酶原激活因子基因(PPO-AF)、溶菌酶基因(LZM)并设计引物，以cDNA为模板，克隆获得PPO，PPO-AF，LZM以及PPO+PPO-AF融合基因的正反向结构，利用XhoⅠ和SwaⅠ酶切位点将以上4个基因的正向结构连入pRCy1载体;利用XbaⅠ和BamHⅠ位点将4个基因的反向结构连入pRCy1载体，构建完成ihpRNA表达盒。　　3.农杆菌介导的ihpRNA表达盒转化进入渐狭蜡蚧菌　　将构建完成的RNAi载体电击转化进入EHA105农杆菌菌株，通过诱导培养和共培养，将质粒ihpRNA表达盒整合进入渐狭蜡蚧菌基因组中，在含有潮霉素B的筛选培养基中获得转化成功的阳性菌株。　　4.转基因渐狭蜡蚧菌的效果评价　　测定转基因蜡蚧菌的单位产孢量和菌丝生长速率，发现与野生型菌株相比，转基因菌株的生长速率没有发生显著性变化;而单位产孢量除La∷GFP菌株显著增加外，其他菌株均没有发生显著变化。　　将转基因菌株在不含潮霉素B的PDA培养基上连续培养10代，利用特异性引物检测菌株的遗传稳定性，发现第十代真菌均可扩增出阳性条带。说明农杆菌介导的转化蜡蚧菌具有较强地遗传稳定性。　　转基因菌株处理柑橘粉虱后，应用实时荧光定量定量PCR技术，对干扰粉虱的靶标基因表达量进行检测，发现与对照菌株La∷GFP相比，La∷PPO，La∷PPO-AF，La∷LZM对各自的靶标基因PPO、PPO-AF，LZM均没有起到干扰沉默的作用，我们推测可能是由于真菌体内dsRNA表达量过低，或者在侵染过程中dsRNA释放不佳造成的。