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目的：选择C—erbB—2（neu）基因中编码两个HLA—A2限制性CTL抗原肽表位p106—114，p369—377的基因片段，将它们分别克隆至pGM—T载体，构建克隆载体pGM—neul（包含p106—114片段）和pGM—neu2（包含p369—377片段），为进一步构建肺癌核酸疫苗及后续研究奠定实验基础。
方法：①小鼠Lewis肺腺癌细胞株的培养：在含10%胎牛血清及双抗（青霉素100 U/ml，链霉素100μg/ml）的RPMI—1640培养基中，37℃、5%CO2常规培养。②免疫组化方法检测小鼠Lewis肺腺癌细胞中C—erbB—2的表达：将对数生长期的小鼠Lewis肺腺癌细胞制成细胞爬片，SP免疫细胞化学染色，光学显微镜下观察细胞形态，细胞膜染成棕黄色颗粒即为C—erbB—2表达。③neul（包含p106—114片段）、neu2（包含p369—377片段）的扩增：用TRIzol法提取Lewis细胞总RNA，用RT—PCR方法扩增neul、neu2基因片段，PCR产物用4%琼脂糖凝胶电泳检测。④PCR产物的回收纯化：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化PCR产物。⑤感受态菌的制备：大肠杆菌DH5α经CaCl2溶液及短暂热休克处理后，即成为感受态菌。⑥pGM—neu1和pGM—neu2载体的构建：目的片段与pGM—T载体在T4 DNA连接酶的作用下进行连接重组，构建pGM—neu1和pGM—neu2载体。⑦连接产物的转化：将两种连接产物分别转化到DH5α感受态菌，通过蓝白筛选挑选重组质粒。⑧重组阳性克隆的PCR鉴定：挑选平板上的白色菌落（阳性重组子）作为模板，分别用neu1、neu2的引物进行PCR扩增，4%琼脂糖凝胶电泳检测重组阳性克隆中是否含有目的片段。⑨pGM—neul和pGM—neu2的提取及纯化：培养PCR鉴定的阳性菌落，用质粒小提试剂盒提取及纯化阳性重组子。⑩DNA测序鉴定：将含有目的基因片段的阳性重组质粒送交Invitrogen公司进行DNA序列测定。
结果：⑴免疫组化染色检测C—erbB—2的表达：结果发现小鼠Lewis肺腺癌细胞有明显深棕色，表现出较强阳性，阳性信号位于细胞膜，说明C—erbB—2在小鼠Lewis肺腺癌细胞中有较高表达。⑵neu1、neu2片段的扩增：从小鼠Lewis肺腺癌细胞中提取总RNA，用RT—PCR的方法获得cDNA，以其为模板，PCR法扩增neu1和neu2，产物进行4%琼脂糖凝胶电泳，在100bp—200bp之间可见两条特异扩增带，片段大小与理论预期相符。⑶重组克隆载体的构建及鉴定：重组阳性克隆的PCR鉴定：白斑菌落分别扩增出约164bp和157bp的条带，与目的片段相符；DNA测序鉴定：将含有目的基因片段的阳性重组质粒送交Invitrogen公司进行DNA序列测定，结果与GeneBank中小鼠C—erbB—2的基因序列一致。
结论：①C—erbB—2在小鼠Lewis肺腺癌细胞中有较高表达。②成功构建了克隆载体pGM—neu1和pGM—neu2，为进一步构建肺癌neu1、neu2核酸疫苗及后续研究奠定了坚实的实验基础，为C—erbB—2高表达的其它肿瘤的治疗提供参考依据。