研究背景骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤,其主要特点就是骨肉瘤细胞中可以见到骨样基质。骨肉瘤主要见于青少年,其累及范围主要在长骨的干骺端。肉眼观骨肉瘤呈鱼肉状,瘤体呈梭形,在骨组织中累及范围较广,包括骨膜、皮质和髓腔。据分析,如果直接进行肿瘤的切除,而不配合放疗、化疗等方法,则其生存率不足五分之一。所以,目前在行保肢手术的同时联合应用顺铂(DDP)、甲氨蝶呤、阿霉素、异环磷酰胺等化疗方法,患者的预后得到了极大的提高,5年生存率明显提高,但这仅仅见于早期没有发生肺转移的患者。但在实际情况下,有多达30%的病人会发生肺转移。对于这一部分患者,其术后放化疗往往效果欠佳,目前其预后仍然较差。近年来随着治疗药物的不断研究,学者们发现了很多具有良好抗肿瘤作用的药物,如雷帕霉素(rapamycin)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)、双膦酸盐等。雷帕霉素是目前常用的一种抗生素,起初发现其还有抗真菌的作用,后来又发现了其免疫抑制的作用,所以这十几年来一直作为免疫抑制剂而使用。近年来研究发现,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin, mTOR)可以抑制肿瘤的增殖,促进肿瘤凋亡。体外靶向抑制mTOR信号也能抑制增殖同时诱导凋亡,目前,国内外还未见有文献报道雷帕霉素联合顺铂来治疗骨肉瘤。本实验主要通过比较雷帕霉素联合顺铂对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖、凋亡的影响,并进一步探讨雷帕霉素联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞凋亡的可能机制,为骨肉瘤靶向治疗提供可靠的实验依据。目的比较雷帕霉素联合顺铂与单用雷帕霉素或单用顺铂对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。并进一步探讨雷帕霉素联合顺铂治疗骨肉瘤的可能机制。材料与方法1.材料入骨肉瘤细胞MG-63,10%胎牛血清,含双抗高糖DMEM,37℃5%CO2培养箱。顺铂,雷帕霉素,AnnexinV凋亡试剂盒(BD),0.25%胰蛋白酶,MTT,DMSO。2.方法实验分为4组：空白组、阳性药1组、阳性药2组、治疗组。顺铂浓度均为10μg/ml,雷帕霉素浓度为20μg/ml,阳性药1组加入RAPA20μg/ml,阳性药2组加入DDP10μg/ml,治疗组加入RAPA20μg/ml并DDP10μg/ml,空白组加入等量生理盐水,均培养24h后进行检测。3.骨肉瘤细胞的增殖抑制率的检测取对数生长期的MG63细胞,接种于96孔细胞培养板中,每孔加100μ1细胞悬液。分4组,每组6个孔。放置于37℃恒温5%CO2恒温箱内培养过夜。分别加入三种不同药物,24h后,每孔加入20μl的MTT (5mg/ml),待其反应4h。去除培养液,PBS洗涤一遍,每孔加入150μl的DMSO,振荡10min,在酶标仪上490nm测定吸光度值。4.流式细胞术检测凋亡取对数生长期的MG63细胞,接种于12孔细胞培养板中。分4组,每组3个孔。放置于37℃恒温5%CO2恒温箱内培养过夜。分别加入不同药物刺激,药物处理24h后,各组细胞制成单细胞悬液于500μ1缓冲液中,加入10μl的Annexin V-FIT和5μl的PI溶液,室温避光15min,流式细胞仪检测。所得数据以AnnexinV-FITC荧光强度为x轴,PI荧光强度为Y轴的散点图分析,参照活细胞的位置,用十字标记将图像分为4个象限检测细胞凋亡。统计学方法应用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据,所有数据均用x±s表示,采用单因素方差分析四组间的整体差异,采用q检验比较组间两两差异,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.MTT结果与空白组比较,其余三组的增殖抑制率均大于空白组,且差异具有统计学意义(P<0.05).治疗组与阳性药1组和阳性药2组比较,增殖抑制率均明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。2.流式细胞仪所得结果2.1流式细胞仪检测单独和联合用药对细胞周期的影响。空白组细胞大多处于G1期,S期次之,G2/M期最少。顺铂或雷帕霉素能改变细胞周期,加大药物浓度或延长作用时间,G1期细胞减少,S期、G2/M期细胞增多,S期、G2/M期稍减少,48小时后,细胞凋亡不断增加,G1期细胞减少,S期、G2/M期细胞增多,两种药物联合使用时未见G1期细胞,时间越长,G1期细胞越少,S期、G2/M期细胞比例相应增多。2.2流式细胞仪检测单独和联合用药对细胞凋亡的影响。与空白组比较,其余三组凋亡率均高于空白组,且差异具有统计学意义(P<0.05),治疗组与阳性药1组和阳性药2组比较,凋亡率均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)结论1.单用雷帕霉素可以抑制骨肉瘤细胞增殖和促进骨肉瘤细胞凋亡。2.单用顺铂可以促进骨肉瘤细胞凋亡。3.联合应用雷帕霉素和顺铂较单独使用两种药物,能更好的抑制骨肉瘤细胞的增殖和促进其凋亡。