论文部分内容阅读
目的 自1990年RH基因的两个cDNA被克隆出来后，对Rh血型系统基因结构的研究进展迅猛，成为输血医学领域的热点。国内对RH基因的研究起步较晚，大多局限于对汉族人的研究，所用方法大多购买国外试剂盒，这些试剂盒大多是针对白种人设计的，且多数检测RH基因的个别多态性。至今为止，国内对RH基因结构的研究不够全面，不能真正代表RH基因结构，对RHD基因的研究多而对RHCE基因的较少。国内至今尚未见RH基因遗传模式的研究报告，很多大中专院校的教材还在用过时的，错误的三复等位基因学说来解释RH基因遗传模式。 初步研究表明，RhD阴性机制具有民族多态性，同样表现为RhD阴性的个体，因种族不同而有完全不同的遗传结构实为少见。弄清RH基因结构和遗传特点已成为中国学者迫在眉睫的重要任务。 本研究期望通过大批量中国汉族人、新疆维吾尔族人和其他部分少数民族RhD阴性样本RHD和RHCE基因结构的研究，以及通过家系研究，试图揭开中国人RHD和RHCE基因结构和遗传特点，得到在中国人中最常见的非表达型RHD等位基因，建立适合中国人的RHD和RHCE基因定型方法。 方法 1．用抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e单克隆和多克隆抗血清常规检测Rh抗原，盐水法阴性样本用间接抗球蛋白试验确认其为Rh抗原血清学阴性，用吸收放散试验检出Del型样本。 2．用PCP-SSP和错配PCR技术检测RHD基因的上游、下游和杂合的Rhesus盒。 3．利用RHD基因10个外显子的多态性位点设计序列特异性引物，使用PCP-SSP法检测RHD基因10个外显子。对每个外显子的PCP-SSP法的检测均用降落PCR技术摸出最佳退火温度。 4．使用PCP-SSP法和多重PCR技术检测RHD基因的启动子区1000bp范围内4个RHD基因的多态性位点，使用PCP-SSP法检测RHD基因的内含子3中37bp插入片段，设计序列长度多态性引物，使用PCP-SSP法检测RHD基因的内含子4。5.使用PCP一SSP法检测RHE/e和RHC/c等位基因和RHCE基因内含子 2中109bP插入序列。6.使用4色荧光测序技术对部分特殊样本测序，对建立的方法用测序技 术进行了验证 结果 228例随机非血缘关系汉族RhD卜)样本中，以ccee表型多见，共130例（57.02%），其次是Ceee，68例（29.82%），第三是CCee型，11例 （4.82%），未检测到CCEe型和CcEE型。72例随机非血缘关系新疆维吾尔族RhD（一）样本中仅检测到ecee、Ceee和CCee三种表型，也是以eeee表型（88.89%）多见，而且比例远远高于汉族人，二者相比有极显著性差异（x’=24.33，P（0.005），Ceee表型（5.56%）和汉族人的相比也有极显著性差异（xZ二17.67，P<0 .005），CCee表型和汉族人的相比无差异（x’=0.0004，P>.05）。228WIJ随机非血缘关系汉族RhD。）样本中检出42例Del型（18.42%），而72例随机非血缘关系维吾尔族RhD（一）样本中未检测到Del型。6例弱D样本均显示阳性结果，但凝集反应弱，3例 “Du型”样本有两例可归为弱D型，一例用盐水法凝集反应为阴性，用间接抗球蛋白试验弱阳性，属于极弱D型。 R五esus盒检测结果显示，在随机非血缘关系Rh阴性汉族人中61 .40%为RHD.服HD一型，34.21%为RHD勺RHD-型，4.39%为RHD十瓜丑D十型。而在新疆维吾尔族人中，检测结果分别为94.44%、2.78%和2.78%。其他6例部分少数民族样本均为RHD’/RHD一型。RHD一/RHD一型组和RHD+瓜月D一型组中，新疆维吾尔族人的检测结果与汉族人的相比有极显著性差异（P<0 .005）。在RHD勺RHD十型组，二者相比无显著性差异（P> .500）。80例代表RHD单基因的KHD十/RHD一型样本（汉族样本78例，维吾尔族样本2例）PJJD基因10个外显子检测结果显示，汉族RhD阴性RHD单基因型中最常见非表达的等位基因为RHD一CE（2一9）一D:型 （19.230，0），其次为RHn（l一10）型（17.95%），接着是RHD一CE(2一7卜DZ型（6 .41%）。2例（2 .56%）与RHD一cE（3一6）一D型相似，其它的等位基因型分别为RHD一cE（6）一D或点突变（2 .56%），盼D一CE（5一6）一D型 （1.28%）。2例维吾尔族样本，1例为RHD一eE(2一9卜n:型，l例为非表达的RHD（1一10）型，均为中国汉族人中最常见而在白种人中非常罕见的 3RHD等位基因。 启动子区l000bP范围内4个RHD基因的多态性位点检测结果显示，RhD阴性样本中，存在RHD基因序列的样本均可检测到这4个多态性位点。有第4外显子的个体均可检测到第4内含子，所有样本均检测不到内含子3和外显子4交界处的37bP插入序列。弱D型和“D‘型”以及De，型大多为RHD十服HD一型样本，RHD基因10个外显子、启动子区和部分内含子的检测结果显示，这些样本的RHD基因结构基本正常。 RHE/e和RHC/c等位基因定型结果表明，RHE/e和RHc的定型结果与血清学的一致，没有发现假阳性和假阴性。利用FJJCE基因外显子1的nt48的C一G多态性检测RHC等位基因将产生6.06%的假阳性，未发现假阴性。利用109bP插入序列这一多态性来检测R圣IC等位基因，总的假阴性率为4.00%，没有发现假阳性率。 家系研究结果显示表型为R瓦D阴性，基因为RHD阳性个体的非表达R