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柑橘裂皮病是一种重要柑橘病害,主要为害以枳或枳的杂种作砧木的柑橘树;而其它砧木的柑橘植株感染裂皮病类病毒后不表现症状。该病在世界范围内广泛分布,严重制约柑橘生产。目前检测柑橘裂皮病的方法有指示植物、聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子检测,其中RT-PCR是一种快速检测柑橘裂皮病的方法,但广西尚未有开展这方面研究与应用的报道。目前,广西柑橘无病毒苗木生产过程中,侧重培育脱除柑桔黄龙病的无病毒苗木,并未重视裂皮病的脱除与检测,因而对广西现有的无黄龙病苗木是否带有柑橘裂皮病的情况尚不清楚。为了快速检测田间柑桔植株、引进的柑桔品种和苗木感染裂皮病情况,需要建立一套快速检测方法,为此开展了本研究,其主要结果如下:
1、比较分析了Trizol法、改良Bugous法、改良异硫氰酸胍法这三种柑桔总RNA提取方法,结果表明:三种方法中Trizol法步骤最简单,耗时最短,但提取总RNA纯度不高,改良Bugous法提取的总RNA纯度、含量最高,虽耗时较Trizol法与改良异硫氰酸胍法较长,但综合考虑,改良Bugous法为最优方法。适于大量样品高质量RNA的快速提取。
2、进行了RT-PCR优化实验,从引物、引物浓度、dNTP浓度、退火温度等方面对RT-PCR进行优化,优化后的RT-PCR能非常稳定地检测出阳性对照中的CEVd,灵敏度高、特异性强,适合对大量田间样品的快速检测。
3、对同一种感病的寄主材料的三个不同方位的成熟叶与嫩叶取样检测,都可以检测到CEVd,说明CEVd的快速检测不受取样部位的限制。运用RT-PCR对宽皮柑橘类、橙类、柚类、枸橼类等30多个柑桔品种(宫川、山川、市文、79-2桠柑、贡柑、普益脐橙、梦脐橙、墨科特脐橙、红肉夏橙、得尔塔夏橙、HB柚、琯溪蜜柚、星路比、藜檬、蕉柑、右江椪柑、夏椪柑、马水桔、宫本、山下红、日南一号、兴津、茂谷柑、暗柳橙、蕉柑、右江桠柑、野生柚子、越南柠檬、越南橙子、越南柚、南瑞白柚)的田间样品柑桔进行检测,每个种类都能检测到CEVd,说明RT-PCR适合于不同柑桔品种田间大量样品的检测。
4、对广西栽培品种、越南品种、中越边境样品、无黄龙病苗木以及无黄龙病接穗的裂皮病快速检测表明:6个供试的广西柑桔栽培品种中有4个带病。14个越南品种中有8个带病。中越边境4个野生柚子品种中有1个带病。宫川、宫本、市文、山下红、日南一号、山川、兴津7个品种,每个品种检测无黄龙病苗木9-10株,结果每个品种有1-7株被检测出带有CEVd。从广西某研究单位采集33个品种的无黄龙病接穗嫁接在网室的实生枳壳苗上,采样进行检测,结果表明:4个脐橙品种有3个带病,6个夏橙品种有3个带病,10个温州蜜柑品种有3个带病,6个柚类品种中有3个带病。