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胰岛素疗效确切,上市己长达八十年,至今仍是各型糖尿病,尤其是中、重度糖尿病患者维持正常血糖水平和治疗糖尿病相关酮症、酸血症及糖尿病性昏迷不可或缺的药物,临床地位十分重要。但是,传统的短中效胰岛素具有作用时间不够长,需要每天多次注射,病人依从性差;皮下注射有吸收峰值;睡前注射有增加夜间低血糖危险等缺点。甘精胰岛素作为一种长效胰岛素,具有每天注射1次即能维持24小时;吸收稳定,吸收后无峰值,减少低血糖发生;具有良好的生物利用度,血糖控制稳定的优点。长效是未来胰岛素的发展方向。研究目的:构建含有短C肽EAEDKR的甘精胰岛素原PET32a-glargine的大肠杆菌表达系统,筛选高效分泌表达的origami(DE3)plysS及origami(DE3)重组工程菌,获得glargine(甘精胰岛素)重组蛋白。建立PET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)由上游构建至破菌、纯化、酶切的生产工艺,得到具有正确活性结构的纯度较高的glargine。研究方法:①PET32a-glargine的上游构建: 1)全基因合成含有短C肽EAEDKR的甘精胰岛素原基因序列。2)利用PET32a质粒上的BamH I及Hind III酶切位点,将glargine插入到PET32a中,构建PET32a-glargine重组质粒。3)将重组质粒转入Jm109工程菌中,筛选高拷贝质粒。4)将高拷贝质粒转入origami(DE3)plysS及origami(DE3)重组工程菌中。5)利用不同筛选压力,诱导剂,诱导方法来获得高表达origam(iDE3)plysS及origami(DE3)菌株。6)优化条件,发酵罐发酵。②PET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)破菌工艺的研究:测试在不同PH及各种破菌液条件下的破菌情况,选择破菌完全且大多以可溶方式存在的破菌条件。③Trx-glargine的纯化与酶切:发酵液经Ni柱及Q柱纯化后,以胰酶酶切,HPLC监测酶切效果。并以反相C-18柱回收,质谱鉴定确定结构。研究结果:①SDS-PAGE、HPLC和质谱分析出glargine的分子量与理论分子量相符。②PET32a-glargine/origami(DE3)表达量高,可达1g/L.③回收率低,仅为40%,但明显高于以往报道。结论:本研究实现了含短C肽的甘精胰岛素原glargine在大肠杆菌系统中的高表达,通过一系列的纯化及酶切最终得到具有生物学活性的glargine目的蛋白。但本方法研究发现虽然PET32a系统可得到较高表达的目的蛋白,但仍有部分蛋白以非可溶性方式存在,质粒中含有的Trx帮助复性有一定意义,回收率高于以往报道。