论文部分内容阅读
背景和目的：卵巢癌（OvarianCancer，OC）是女性生殖器官常见的肿瘤之一，虽然发病率次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位，但它是死亡率最高的妇科肿瘤，患病初期症状隐匿，造成确诊时60-70％的卵巢恶性肿瘤患者已至晚期，常规的手术和内分泌及化学疗法均无法扭转这些患者的生存期，寻找新的治疗卵巢癌的方法迫在眉睫。近年来，人们对肿瘤的研究逐步向分子领域蔓延，以期通过基因治疗达到治愈肿瘤的目的；细胞凋亡调控的紊乱是肿瘤发生、发展的一个重要环节，其中凋亡抑制蛋白家族（Inhibitorofapoptosisproteins，IAPs）是近些年来的一个研究热点。并且研究发现：与卵巢癌有关的IAPs主要XIAP、survivin和CIAP2。目前，有关siRNA沉默survivin基因和XIAP基因对卵巢癌A2780-s细胞凋亡作用的研究还未见报道。本实验中旨在探讨：（1）survivin，XIAP基因分别在A2780-s细胞中的作用（2）双靶点surviving-siRNA、XIAP-siRNA对卵巢癌A2780-s细胞凋亡的影响。（3）survivin，XIAP之间的相互作用，以期达到为卵巢癌的治疗提供新靶点。
方法：研究对象为人卵巢癌细胞系（A2780-s）。（1）设计并且构建针对survivin和XIAP化学合成的siRNA；用DMEM培养基培养卵巢癌A2780-s细胞，取对数生长期的细胞分别进行以下实验。设计空白对照组（Blank组）、双转染组（Survivin-siRNA与XIAP-siRNA）半量混合转染、单转Survivin-siRNA、单转XIAP-siRNA、脂质体转染组（Mock）；（2）通过蛋白质印迹法（Westernblot）检测Survivin、XIAP蛋白在转染48h后的蛋白表达情况；（3）PI染色观察细胞转染48h后细胞的凋亡情况；（4）通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪分析各组细胞凋亡率；（5）MTT法检测细胞增殖率。
结果：（1）成功培养卵巢癌细胞株；（2）westernblot结果证实survivin和XIAP蛋白在卵巢癌细胞A2780-s中有表达，并且单、双转染组的蛋白表达明显受到抑制，单转染survivin-siRNA组、单转染XIAP-siRNA组、双转染组的蛋白表达量分别是0.35、0.32、0.21（P<0.05），而空白对照组、Mock组分别是1.00、0.89（P>0.05），对照组的蛋白表达量均高于转染组；（3）PI染色结果显示细胞调亡形态学变化，图示转染组细胞明显减少，双转染组尤为显著，可见细胞核固缩，碎片，体积变小及凋亡小体形成，共转染组较其单转组结果更为明显，药物组细胞也相对减少，但是相对双转组细胞稍多；（4）通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪测得各组细胞的凋亡率，双转染组、单转Survivin-siRNA、单转XIAP-siRNA的凋亡率分别为29.67％、18.82％、19.18％（P<0.05）；空白对照组、脂质体转染组凋亡率分别为：1.35％，4.51％（P>0.05）无明显的差异，且转染组均高于对照组；（5）MTT法检测转染和未转染的卵巢癌细胞的增值情况。双转染组、单转survivin-siRNA组、单转XIAP-siRNA组细胞的存活率分别为49％±0.56、58％±0.46、54％±0.37，转染组细胞的存活率均低于对照组，而双转染组细胞的存活率明显低于单转组（P<0.05）。
结论：（1）Survivin、XIAP基因在卵巢癌细胞株中有表达。（2）双靶点survivin-siRNA、XIAP-siRNA能有效抑制两个基因在卵巢癌细胞.A2780-s中的蛋白表达。（3）RNA干扰survivin、XIAP基因后，能有效的促进卵巢癌A2780-s细胞的凋亡，抑制细胞的增值。