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唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)的嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)特性非常独特,与其它头颈部肿瘤常见的生物学特征不相符。近些年不断有学者提出肿瘤的研究应在全基因组层面上研究所有基因的相互作用,从而对肿瘤有全面系统的认识。而传统的基因芯片(genechip)分析依赖于已知的基因组信息,这也是该技术的最大局限。RNA-seq技术可以揭示未知的转录本、遗传多态性(genetic polymorphism)以及基因融合(gene fusion),而基因芯片只能检出明确的已知目标。如果测序深度足够,RNA-seq技术相比于基因芯片更能高效的检测出高丰度以及低丰度的转录本。目前RNA-seq技术被广泛运用到分析差异表达基因(differential gene express,DGE),研究可变剪切(alternative splicing)以及发现新转录本(transcript)等方面,其相对于传统的测序方法具有压倒性优势。并且随着第二代测序技术的成熟、发展以及未来测序成本的进一步降低,RNA-seq技术的应用领域也会越来越广泛。本项目采用RNA-Seq技术分析共培养前后的唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)和施万细胞的基因表达水平变化,以挖掘PNI高度相关差异表达基因。结合筛选到的PNI高度相关差异基因的实验结果,课题组前期实验基础以及文献复习结果,我们认为施万细胞通过NT-3/Trk C信号通路促进了SACC-83细胞的嗜神经侵袭(PNI)特性。故我们采用ELISA、q RT-PCR、Western免疫印迹、划痕实验、Transwell嗜神经侵袭及3D培养实验等方法,明确在唾液腺腺样囊性癌独特的PNI演进过程中,NT-3/Trk C信号通路是否扮演了重要角色。并进一步采用腺样囊性癌肿瘤标本进行免疫组化实验,对前期结论进行验证,并且对患者进行随访以及查阅相关病例,研究分析NT-3、Trk C在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达与临床PNI及患者预后之间的关联。第一部分实验目的:基于RNA-Seq技术分析共培养前后的涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)和施万细胞的基因表达水平变化,挖掘嗜神经侵袭相关基因。方法:采用腺样囊性癌细胞与SD大鼠仔鼠坐骨神经施万细胞共培养模型,分析共培养前后SACC-83细胞和施万细胞基因表达水平变化,对差异表达基因进行聚类分析、GO(gene ontology)功能富集分析、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,并采用q RT-PCR对其中6个关键差异表达基因进行验证。采用edge R软件(3.12.1)进行表达差异显著性分析,将p≤0.05,差异表达倍数(foldchange)的绝对值大于1作为差异显著性标准。结果:在腺样囊性癌细胞单独培养组与共培养组之间发现395个差异表达基因(p-value≤0.05,|log FC|≥1.0),其内有135个基因上调(34.2%),260个基因下调(65.8%);在施万细胞单独培养组与共培养组之间发现1239个差异基因(p-value≤0.05,|log FC|≥1.0),其内有757个基因上调(61%),482个基因下调(39%)。GO功能富集分析结果表明这些PNI相关差异表达基因参与了血管再生、细胞外基质的组成、细胞的增殖、凋亡、上皮形态发生、细胞迁移和细胞运动等生物过程;KEGG通路富集分析结果表明其参与组氨酸代谢、肿瘤坏死因子、趋化因子等细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt通路,黏着斑通路,ECM受体相互作用等重要生物学通路。采用q RT-PCR技术对其中6个关键差异表达基因进行验证,验证结果与RNA-Seq结果趋势一致。结论:通过RNA-Seq技术得到了涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭(PNI)高度相关差异基因,为阐明SACC的嗜神经侵袭机制提供重要实验依据,也为临床治疗嗜神经侵袭提供新策略和新靶点。第二部分实验目的:研究肿瘤-神经共培养状态下施万细胞对SACC-83细胞的侵袭、迁移能力的影响及具体分子机制。方法:Schwann cells的原代培养来自于SD大鼠仔鼠的坐骨神经,获取细胞后进行纯化。将施万细胞和肿瘤细胞通过Transwell共培养系统共同培养72小时。酶联免疫吸附实验检测各培养组培养基中NT-3的含量,实时定量PCR、Western免疫印迹法检测NT-3、Trk C在各组细胞内的表达情况,共培养条件下肿瘤细胞和神经细胞的侵袭、迁移能力利用侵袭、迁移实验来评价。嗜神经侵袭3D模型动态观察肿瘤微环境的变化以及SACC-83细胞和SCs定向迁移的时空特征。实验结果采用SPSS17.0软件包进行统计学处理。结果:ELISA实验发现共培养组SACC-83细胞NT-3含量升高明显;q RT-PCR和western blot实验发现,共培养组SACC-83细胞中NT-3表达量升高明显,共培养组施万细胞中Trk C表达显著增多;细胞划痕实验和transwell侵袭实验表明,SACC-83和施万细胞的侵袭、迁移能力在共培养条件下均得到增强,而K252a(Trk C抑制剂)对以上现象有明显的抑制作用,能够使两种细胞的运动能力显著降低;3D共培养实验观察SACC-83和施万细胞的相互吸引过程结果显示,施万细胞在3D培养条件下,可早期定向迁移趋化至肿瘤细胞,与此同时施万细胞也向NT-3高浓度区发生有规律的移动;CCK8细胞增殖实验以及凋亡实验表明,NT-3对SACC-83细胞有轻微的凋亡抑制作用。结论:通过NT-3/Trk C信号通路,施万细胞对腺样囊性癌细胞(SACC-83)的PNI特性起到了促进作用,通过抑制NT-3/Trk C信号通路为靶向治疗SACC嗜神经侵袭特性提供了另一种可能性。第三部分实验目的:研究分析NT-3、TrkC在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达与临床PNI及患者预后之间的关联。方法:采用免疫组化染色法分析了2007-2011年78例SACC标本和25例正常涎腺组织中NT-3、Trk C的表达情况,并通过打电话和查阅病例对患者进行了随访和资料的统计,实验结果采用SPSS17.0软件包进行统计学处理。结果:NT-3和Trk C在SACC标本中呈现高表达,且在肿瘤-神经交界的微环境中显著高表达。在SACC组织中NT-3和Trk C表达水平与PNI,远处转移和临床分期呈现正相关。NT-3分子的表达水平与SACC患者的预后呈负相关。结论:在SACC组织中NT-3和Trk C表达水平与PNI,远处转移和临床分期呈现正相关,PNI相关NT-3分子的表达水平与SACC患者的预后呈负相关。