目的:血液恶性肿瘤的免疫治疗在近几年已经实现了重大的突破。然而,部分患者免疫治疗后出现耐药和复发,不同患者或同一患者不同阶段,对相同免疫疗法反应不同,存在严重异质性,然而,我们现阶段,对免疫治疗异质性的理解还严重不足。传统的研究方法是基于大样本,从整体水平来研究肿瘤对治疗的反应,而忽视了单个免疫细胞活性状态的差异,免疫突触的形成,免疫细胞对肿瘤靶细胞的识别,以及免疫细胞杀伤效率存在异质性的问题。为了克服这个缺陷,本课题基于急性髓系白血病(AML)免疫治疗的需求,设计了能在单细胞层面观察免疫细胞和白血病细胞相互识别,相互作用的微流控芯片。运用该微流控芯片,能够精确控制白血病细胞和T细胞的数量和比例,以及所处的内环境,同时,利用微流控芯片高通量的优点,能够一次追踪大量的T细胞与白血病细胞之间动态的相互作用。我们期望我们建立的单细胞研究平台在未来,有潜力可以作为辅助诊断工具,更好的评估患者接受过继性免疫细胞疗法的疗效以及异质性,为临床个体化的免疫治疗方案的设计提供技术支持。方法:1.设计并制备一种微流控芯片,与细胞原位孵育系统及显微镜延时成像系统(time-lapse imaging)整合,追踪T细胞和白血病细胞的动态运动轨迹,以定量分析T细胞的效应功能。2.通过调控输入细胞浓度的初始浓度,从1?10~6/m L-20?10~6/m L,以及不同的效靶比,以使单个微流控芯片井中获得最佳的T细胞-白血病细胞对。3.选择OT-I＿OVA体系用于体外单细胞研究抗原提呈,T细胞活化。细胞分组情况如下:(1)阳性对照组:OT-I＿C1498-OVA+;(2)阴性对照组:Na?ve T细胞＿C1498-OVA+,Na?ve T来自于普通C57BL/6小鼠的脾脏;(3)阴性对照组:OT-I＿C1498-OVA-。4.Fluo-4钙离子荧光探针预处理OT-I细胞,研究T细胞免疫突触形成的异质性。5.充分混合的OT-I细胞和C1498细胞悬浮液中加入小鼠来源抗PD-1抗体,来研究免疫检查点抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响。实验分两组:(1)治疗组:OT-T＿C1498+PD-1抗体;(2)对照组:OT-T＿C1498。结果:1.我们发现OT-I＿C1498-OVA+组显示出明显更高的细胞死亡,且随时间不断增加,显著高于Na?ve T细胞＿C1498-OVA+和OT-I＿C1498-OVA-组,5小时内三组的细胞死亡率分别为32.89%,16.09%和14.75%。63.28%的OT-I细胞能够在5小时内杀死了一个或多个OVA+的白血病细胞(C1498),对OVA-的C1498细胞,仅有9.51%的OT-I细胞能够识别并且发挥细胞毒作用,同样,Na?ve T细胞对C1498细胞基本不能识别,仅表现了非特异性杀死,杀伤率为8.30%,后两组比较(OT-I＿C1498-OVA-和Na?ve T细胞＿C1498-OVA+)没有明显的统计学差异。2.由于T细胞抗原受体的参与和T细胞活化,同一来源的单个T细胞发挥细胞毒性所需的时间具有很强的异质性。51%的OT-I细胞能够在50分钟内杀死白血病C1498细胞。只有16.3%的OT-I细胞能够在20分钟内杀死白血病细胞,在20-30分钟之间杀死白血病细胞的T细胞占14.5%。自T细胞的激活,18.2%的T细胞需要大于等于60分钟才能杀死白血病C1498细胞。3.T细胞发挥杀伤作用时,T细胞与白血病细胞之间的初始距离从0μm到18μm不等。当T细胞和C1498细胞直接接触时,有85%的C1498细胞被杀死,而初始距离在1至15μm之间时,有15%的C1498细胞被杀死。4.同种来源的T细胞杀伤能力的异质性:有54.5%的T细胞在5小时内杀死了1个白血病细胞,而有4.9%的T细胞杀死了2个白血病细胞,只有0.78%的T细胞杀死了3个或更多的白血病细胞,剩余占39.8%的T细胞没有杀死任何白血病细胞。5.从最初的白血病细胞与T细胞相互接触到白血病细胞死亡,我们总共分析了522个被T细胞杀死的白血病细胞。细胞死亡时间从20分钟到300分钟不等,重要的是,自T细胞与靶细胞最初接触,有90%的杀伤发生在相互接触90分钟之后。白血病细胞死亡数量最多是发生在接触后3.5小时到4小时,占死亡总数的22.4%。6.我们分析了对照组中1024个OT-I细胞的杀伤效率和有PD-1抗体的实验组中的777个OT-I细胞的杀伤效率。结果显示:微环境中加入PD-1抗体后,OT-I细胞在5小时内的杀伤效率明显增强,并且PD-1抗体能部分加速T细胞对靶细胞的杀伤。在3.5小时的时候,对照组和治疗组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为37.52%±5.33 vs 61.48%±7.86(p<0.05);在5小时的时候,两组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为63.28%±2.93 vs 73.04%±3.7(p<0.05)。7.在5小时内,在对照组中,没有发挥细胞毒性的T细胞占总T细胞的39.8%。而在使用了PD-1抗体的实验组中,仅有27.3%的T细胞没有发挥细胞毒性,明显低于对照组(p<0.05)。此外,在对照组中,分别杀死1、2和3个白血病C1498细胞的T细胞分别占统计的总的T细胞数量的54.47%,4.92%和0.77%,均明显低于加入了PD-1抗体的治疗组,治疗组结果为:60.77%,10.53%和1.43%。8.在行免疫检查点(PD-1)抑制治疗后,在对照组(没有用PD-1抗体)中,在2小时内被T细胞攻击致死的C1498细胞数量占死亡总数的12.06%,而在治疗组中,2小时内被杀死细胞的比例为30.85%。在治疗组中,当C1498细胞与T细胞接触时间在3-3.5之间,细胞死亡的比例达到最大,比对照组的3.5-4小时达到最大比例提前了半小时。结论:使用我们的微流控芯片和OT-I＿OVA系统能够很好的体外观察T细胞的抗原识别,杀伤,具备在单细胞水平研究T细胞-靶细胞相互作用的异质性的可行性。本研究成功阐述了单个免疫细胞-靶细胞的异质性,以及免疫检查点抑制(PD-1/PD-L1)对细胞异质性的影响。此外,从方法学来看,这项研究基于微流控芯片,为探讨细胞间间隙连接,细胞内脂质变化,旁分泌以及细胞耐药提供了一个新的技术平台。此平台具有方便,快速,高通量和易操作的优点。能够为研究疾病的早期诊断以及细胞间的相互作用提供帮助。该技术平台为在单细胞水平上研究癌症免疫治疗的疗效和耐药性开辟了新的途径,增强我们对癌症免疫治疗基础理论的探索,为设计个性化的癌症免疫疗法提供理论支持。