一.研究背景支气管哮喘(Bronchial asthma, asthma)是一种由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等炎症细胞、气道上皮细胞和细胞组分所介导的具有复杂免疫机制的气道慢性过敏反应炎症性疾病。主要表现为气道内嗜酸性粒细胞浸润、粘液分泌增多以及对外来吸入性过敏原和非特异性刺激的气道反应性增高。哮喘时气流阻塞可为可逆、部分不可逆甚至完全不可逆,导致临床表现复杂多变,增加了治疗的难度,并影响疾病的转归。目前有效的抗炎治疗并不能根治哮喘,不能完全消除气道高反应性,因此在气道炎症和气道高反应性之间存在着一个明显的“关联缺失”。作为哮喘的一个关键基本特征-气道重塑,它将哮喘气道炎症和气道高反应性联系在一起。气道重塑指的是哮喘时发生在气道壁的结构改变,这些改变包括气道壁增厚,上皮损伤和上皮细胞增生,上皮下纤维化,杯状细胞化生和粘液转化,肌纤维母细胞增生和肌细胞增生与肥大,血管异常,基质蛋白沉积及腺体增生肥大等。作为气道重塑主要结构成分之一-气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)的地位越来越得到重视。ASMC不仅是气道炎症损伤的靶细胞,而且作为效应细胞主动参与了哮喘的病理过程(气道炎症、气道重塑和气道高反应性)和病情的加重。目前普遍认为ASMC的增生过度和凋亡减少在哮喘气道重塑中占有十分重要的地位。遗憾的是,现今的哮喘诊治方案,均强调吸入糖皮质激素对气道炎症的控制,而对哮喘气道重塑重视不够,且现行的治疗方法尚不能有效的阻止甚至逆转气道重塑的发生和发展。正因为如此,近年来ASMC已成为哮喘研究的一个新热点,越来越多的研究学者提出应把ASMC作为支气管哮喘研究和治疗的标靶。所以,进一步揭示ASMC参与哮喘的相关机制,对开辟哮喘治疗的新思路具有重要意义。10号染色体上磷酸酶与张力蛋白同源缺失性基因PTEN(phosphase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)亦称MMAC1基因(mutated in multiply advanced cancer1,多种晚期癌症中发生突变的基因,或者多发性进展期癌症突变基因)或TEP-1基因(TGF-β1 regulated and epithelial cell-riched phosphatase 1,由TGF-β1调控并在上皮细胞中高度表达的磷酸酶),定位于10q23.3,全长200 kb,是1997年由3个小组发现的第一个既具有抑癌功能,又具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,在胚胎的发育、细胞增殖和凋亡、细胞周期的调节、迁移(侵袭)和细胞骨架等方面起着重要的调控作用。已有的研究发现在人类多种肿瘤中,如前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等,都存在PTEN基因表达的改变。随着研究的深入,人们也发现PTEN基因在非肿瘤性疾病,如：心肌肥大、高血压动脉粥样硬化、支气管哮喘、肾纤维化以及缺血性脑中风等疾病中也发挥了重要的作用。PTEN基因能够编码由403个氨基酸组成的蛋白质-PTEN蛋白,其属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员,是一个双重特异性蛋白磷酸酶,调节酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导的信号转导,在维持正常细胞的稳定性中发挥着重要的作用。PTEN蛋白可能通过其脂质磷酸酶/蛋白磷酸酶活性直接或间接地的调节了复杂的信号网络系统而发挥作用。PTEN蛋白可以调控磷脂酰肌醇-3-激酶信号传导通路(PI3K/PKB/Akt信号级联)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路(Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号级联),同时PTEN还能特异性的诱导细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21、p27等的表达增加,下调细胞周期蛋白CyclinD1的表达,而上述这些信号分子同时也是介导ASMC生长、生存功能的主要信号分子。鉴于既往的研究显示,PTEN能通过调节PI3K/Akt、MAPK和细胞周期相关蛋白的表达来影响肿瘤细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞的生长和生存,我们推论PTEN对ASMC也有相似的作用。所以,进一步深入的研究PTEN对PI3K/PKB/Akt、MAPK及其下游的信号分子、细胞周期素依赖性激酶抑制因子和细胞周期蛋白等相关的信号传导分子的影响,从而初步阐明PTEN调控ASMC生长、生存的机制,期望能为PTEN参与哮喘的气道重塑提供理论和实验的依据。二.研究目的通过将携带野生型PTEN cDNA的腺病毒载体(Ad-PTEN-GFP):转染体外培养的人气道平滑肌细胞(Airway Smooth Muscle Cell, ASMC),实现PTEN基因的过表达,并以仅携带绿色荧光蛋白GFP的阴性对照腺病毒(Ad-GFP)转染组和只添加无血清培养基DMEM的空白组作为对照,初步研究PTEN基因对ASMC凋亡和细胞周期相关信号分子通路的影响。三.材料和方法1、人气道平滑肌细胞(ASMC)的分离、培养与鉴定：分离肺叶切除术患者切除的相对正常肺叶、肺段支气管标本,按照相关文献报道和本课题小组已经成熟的方法,采用组织块贴壁培养法进行人气道平滑肌细胞的培养,取3-8代的气道平滑肌细胞用于实验。在倒置显微镜下观察细胞生长和形态,并用抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体(α-SM actin)行免疫细胞化学染色鉴定为人气道平滑肌细胞。2、实验分组：将实验细胞分为以下3组：①过表达PTEN组(Ad-PTEN):应用腺病毒载体携带野生型PTEN基因以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)=100体外转染ASMCs;②阴性对照组(Ad-GFP):应用腺病毒空载体携带绿色荧光蛋白GFP以感染复数=100体外转染ASMCs;③空白对照组(DMEM):只添加无血清培养基DMEM体外培养ASMCs。3、重组腺病毒感染ASMCs:选择处于对数生长期的ASMCs,加入用无血清的DMEM稀释的病毒液,置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育,6-8 h后补加含有血清的完全培养基,继续孵育24h后,更换完全培养基,通过在倒置荧光显微镜下和流式细胞术检测观察病毒转染效果。4、CCK-8法检测病毒转染后的细胞毒性和3组气道平滑肌细胞的生长状况。5、Hoechst-33342染色观察3组气道平滑肌细胞凋亡情况。6、PE-7AAD双标流式细胞术检测3组气道平滑肌细胞凋亡情况。7、PI单染后流式细胞术检测3组气道平滑肌细胞各自的细胞周期分布情况。8、Western blotting免疫印迹法检测四组气道平滑肌细胞的PTEN、p-Akt、total-Akt、p-ERK1/2、total-ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspases-9、p21、CyclinD1蛋白以及内参β-actin的表达。9、所有原始数据用x±s表示,用SPSS13.0软件进行统计分析。两组均数比较采用t检验。多重比较采用One Way ANOVA分析,组间比较采用LSD/Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。四.结果1、倒置显微镜在×100倍镜下观察,ASMCs未汇合之前多呈梭形或多边形,细胞汇合后部分区域的细胞成束状排列,呈典型“峰与谷”状。对平滑肌细胞特异的α-肌动蛋白(α-SM actin)进行免疫细胞化学染色,在×400高倍镜下可见α-SM actin在气道平滑肌细胞胞浆内均匀分布,呈棕色平行纤维丝状结构。传至第3-4代,平滑肌细胞纯度为95%。2、Ad-GFP转染人ASMCs 1d后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明重组腺病毒载体成功转染ASMC。转染2d后荧光显微镜低倍镜下满视野皆可见转染阳性的平滑肌细胞呈现明显绿色荧光。MOI=100转染2d后,荧光显微镜观察下显示转染效率达(95.19±0.39)%,流式细胞检测显示转染效率可达(96.20±0.33)%。3、CCK-8法检测3组气道平滑肌细胞的生长状况和细胞毒性：转染腺病毒载体Ad-PTEN组、Ad-GFP组、空白对照组细胞第1、2、3天450 nm处吸光度值有统计学差异(F=480.63、06.644、89.592, P=0.000), Ad-PTEN组吸光度值明显低于Ad-GFP组和空白对照组(P<0.05),表明Ad-PTEN组细胞的增殖低于阴性对照和空白对照组；进一步检测Ad-GFP组和空白对照组对细胞的生长和毒性情况,发现两组第1、2、3天在450 nm处吸光度值无统计学差异(t=-0.327、1.149、-1.732,P=0.748、0.270、0.105),表明空载病毒对细胞的生长无影响且无细胞毒性。4、Hoechst-33342染色观察3组气道平滑肌细胞凋亡情况：转染腺病毒Ad-PTEN组、Ad-GFP组和空白对照组第2、3、5、7天所测得的细胞凋亡率相比较,差异无统计学意义(F值=1.650、0.412、0.085,P=0.245,0.674,0.919)。表明转染PTEN基因并不能诱导正常的ASMCs产生凋亡。5、PE-7AAD双标流式细胞术检测3组气道平滑肌细胞凋亡情况：转染腺病毒载体Ad-PTEN、Ad-GFP组和空白对照组第2、3、5、7天PE-7AAD双标流式细胞术检测,3组的凋亡率无明显统计学差异(F=1.988、2.569、0.127、0.064,P=0.191,0.131,0.882、0.939),也同时证明表明转染PTEN基因并不能诱导正常的ASMCs产生凋亡。6、Western blotting免疫印迹法检测PTEN蛋白的表达：成功转染腺病毒载体Ad-PTEN后,过表达PTEN基因组细胞的PTEN蛋白表达增强；而Ad-GFP组和空白对照组PTEN蛋白的表达无明显变化。7、Western blotting免疫印迹法检测Akt蛋白的表达：转染腺病毒载体Ad-PTEN后,过表达PTEN基因组细胞的p-Akt表达显著减少,但3组细胞的total-Akt表达无明显差异。8、Western blotting免疫印迹法检测ERKl/2蛋白的表达：转染腺病毒载体Ad-PTEN后,p-ERK1/2和total-Akt的表达与Ad-GFP组和空白对照组相比较无明显差异。9、Western blotting免疫印迹法检测cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白的表达：转染腺病毒载体Ad-PTEN与Ad-GFP组和空白对照组相比较,3组的cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白表达无明显差异。10、PI单染的流式细胞术细胞周期检测结果：转染腺病毒载体Ad-PTEN 48h后,G0-G1期细胞增多,S期细胞和G2/M期细胞则减少。Ad-PTEN组、Ad-GFP组、空白对照组细胞G0/G1期相比较,差异均有统计学意义(F=8.333,P=0.005)。Ad-PTEN组G0/G1期细胞与Ad-GFP组、空白对照组相比有统计学意义P<0.05)。表明转染Ad-PTEN能阻滞细胞在G0/G1期。11、Western blotting免疫印迹法检测p21蛋白的表达：转染腺病毒载体Ad-PTEN组与Ad-GFP组和空白对照组相比较,p21蛋白的表达明显上调,而Ad-GFP组和空白对照组相比较表达无明显差异。12、Western blotting免疫印迹法检测CyclinD1蛋白的表达,转染腺病毒载体Ad-PTEN组与Ad-GFP组和空白对照组相比较,CyclinD1蛋白的表达明显下调,而Ad-GFP组和空白对照组相比较表达无明显差异。五.结论本研究通过采用基因过表达技术,研究了过表达肿瘤抑制基因PTEN对气道平滑肌细胞(ASMC)凋亡和细胞周期的影响,并初步探讨了p-Akt、total-Akt、p-ERK1/2、total-ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspases-9、p21、CyclinD1等信号分子的变化情况,通过上述研究我们得到了以下结论：1、腺病毒介导的表达系统能高效瞬时的在体外转染ASMC。其转染ASMC的效率可以达到95%左右。转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。2、PTEN基因的过表达不能诱导ASMC产生凋亡效应。Hoechst-33342染色、PE-7AAD双标流式细胞技术和免疫印迹cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白的表达均证实了这点。此结果与PTEN基因能诱导某些类型的细胞凋亡的结论不同。3、PTEN基因的过表达能够抑制ASMC的增殖和细胞周期进展,G0-G1期细胞的比例增多,而S期和G2/M期细胞的比例减少。这与PTEN作用于其他类型的细胞的结果相似。3、过表达PTEN基因能下调p-Akt调节细胞增殖而对p-ERK1/2、total-Akt、total-ERK1/2无影响；过表达PTEN基因能下调CyclinD1蛋白,同时上调p21蛋白参与ASMC细胞周期的调控。