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目的研究淡豆豉炮制过程中微生物调控γ-氨基丁酸(GABA)形成的机制,明确微生物数量和种群间相互关系在GABA形成中的作用,为阐释淡豆豉炮制中GABA形成机制奠定基础。方法一、淡豆豉炮制、取样和GABA含量测定1、本实验按照实验室前期建立的规范的淡豆豉炮制工艺炮制淡豆豉,获取淡豆豉不同炮制时间点的样本和成品淡豆豉。2、利用本实验室前期建立的高效液相色谱-质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS),测定淡豆豉不同炮制时间点样本中GABA和谷氨酸(Glutamic acid,Glu)的含量。二、淡豆豉炮制中产GABA微生物的生理生化特性测定1、产GABA微生物的生长特性通过查阅文献资料了解枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、鸟肠球菌、屎肠球菌、黑曲霉、溜曲霉、米根霉、桔青霉、鲑色锁掷酵母菌、极细支孢霉、黄曲霉、白腐菌的生长特性。2、产GABA微生物在不同p H、温度下产酶能力的测定(1)采用Berthelot比色法测定解淀粉芽孢杆菌、鸟肠球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、溜曲霉、米根霉、桔青霉、鲑色锁掷酵母菌、极细支孢霉、黄曲霉、白腐菌在不同p H、温度条件下产谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)能力。(2)采用福林酚法测定解淀粉芽孢杆菌、鸟肠球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、溜曲霉、米根霉、桔青霉、鲑色锁掷酵母菌、极细支孢霉、黄曲霉、白腐菌在不同p H、温度条件下产蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶)能力。三、产GABA优势微生物在淡豆豉炮制中的定量分析1、淡豆豉炮制不同时间点总DNA提取方法的比较研究采用蛋白酶K-SDS法、液氮-SDS-溶菌酶法、溶菌酶-SDS-CTAB法和溶菌酶-蛋白酶K-SDS法分别提取不同时间点样品微生物总DNA,以期找到提取淡豆豉中微生物总DNA的适宜的方法。2、荧光定量PCR方法的建立应用实时荧光定量PCR技术对淡豆豉炮制样品中产GABA的微生物鲑色锁掷酵母菌、屎肠球菌及枯草芽孢杆菌进行绝对定量,分析它们在淡豆豉炮制过程中的数量变化。四、统计分析应用散点图、单因素方差分析、交互作用作图及相关性分析研究微生物种类、微生物数量、DGGE、荧光定量数据结果与GABA含量关系,产GABA优势菌产蛋白酶、GAD能力与产GABA能力相关关系。明确微生物数量和种群间相互关系在GABA形成中的作用。结果一、淡豆豉炮制、取样和GABA含量测定GABA、Glu的含量在淡豆豉自然炮制过程中呈上升趋势,“黄衣上遍”阶段GABA含量很低或未检测出,Glu含量增长缓慢,在0.74 mg/g-0.83 mg/g之间;“再闷”阶段GABA含量上升至6.16 mg/g,Glu含量从7.93 mg/g上升至12.20mg/g。二、淡豆豉炮制中产GABA微生物的生理生化特性测定1、产GABA微生物的生长特性枯草芽孢杆菌能够抵抗80℃高温,在枯草浸汁中大量繁殖。鸟肠球菌和屎肠球菌对营养要求较高,生长温度10～45℃、p H值4.5～9.6。解淀粉芽孢杆菌在p H5.0-9.0可良好生长,最适温度为28～30℃。黑曲霉好氧,最适生长p H5.0-6.0,最适生长温度37℃。黄曲霉最适生长相对湿度80%～90%,最适生长温度25～30℃。黄曲霉毒素只有在100～120℃高温高压长期作用的条件下才能失活。极细支孢霉菌丝生长最适温度25℃,分生孢子产生最适温度20℃,菌丝生长和孢子萌发最适p H值为4-6。米根霉生长温度30～35℃,最适温度37℃,41℃亦能发育。2、淡豆豉炮制中产γ-氨基丁酸微生物在不同p H、温度下产酶能力的测定12种微生物在p H 5～7、28～37℃范围内产GAD和蛋白酶酶活较高。其中黄曲霉产GAD酶活最高为41.97 U/h,最适p H7、温度28℃,其次是鲑色锁掷酵母菌、黑曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌,酶活分别是29.04、25.78、22.42、19.43 U/h。枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶活最高为24.80 U/m L,最适p H 7、温度37℃,其次是解淀粉芽孢杆菌、米根霉、鸟肠球菌,酶活分别是16.86、12.51、9.18 U/m L。解淀粉芽孢杆菌产碱性蛋白酶活最高为13.29 U/m L,最适p H 7、温度34℃,其次是枯草芽孢杆菌、米根霉,酶活分别是8.86、6.20 U/m L。12种微生物产酸性蛋白酶能力普遍较差。三、产GABA优势微生物在淡豆豉炮制中的定量分析1、淡豆豉炮制不同时间点总DNA提取方法的比较研究蛋白酶K-SDS法比液氮-SDS-溶菌酶法、溶菌酶-SDS-CTAB法和溶菌酶-蛋白酶K-SDS法提取的总DNA质量更高。2、三种产GABA优势菌的定量对鲑色锁掷酵母菌、屎肠球菌及枯草芽孢杆菌进行实时荧光定量PCR检测定量,荧光定量PCR标准曲线线性关系及方法学考察结果如下:(1)鲑色锁掷酵母菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌的标准曲线分别为:y=-3.377x+40.11(R~2=0.9991),y=-3.416x+39.005(R~2=0.9997),y=-3.2667x+38.108(R~2=0.999)。(2)灵敏度考察结果:鲑色锁掷酵母菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌的最低检测限度分别为:4.50、3.67、2.79copies/μL。(3)特异性考察结果:各引物溶解曲线单一,表明引物特异性良好。(4)重复性考察结果:屎肠球菌和枯草芽孢杆菌的组内重复性变异系数小于1%,鲑色锁掷酵母菌组内重复性变异系数小于2%,屎肠球菌、鲑色锁掷酵母菌、枯草芽孢杆菌组间重复性变异系数均小于1%,表明建立的方法的重复性合格。(5)定量结果:检测发酵0天、发酵6天、再闷3天、再闷9天、再闷15天样品中微生物的数量,鲑色锁掷酵母菌的拷贝数分别是:9.20×10~3、8.60×10~4、2.22×10~7、1.99×10~4、1.50×10~4copies/g;枯草芽孢杆菌的拷贝数分别是:2.25×10~6、1.82×10~6、1.48×10~7、3.62×10~7、6.38×10~7copies/g;屎肠球菌的拷贝数分别是:6.50×10~4、7.10×10~5、1.80×10~6、3.51×10~6、3.33×10~6copies/g。四、统计学分析细菌种类、细菌数量、霉菌数量、酵母菌数量、枯草芽孢杆菌、米曲霉、卵形丝孢酵母与GABA含量Pearson相关系数分别为-0.972、-0.965、-0.984、-0.975、0.952、-0.953、-0.885,显著性分别为0.006、0.008、0.002、0.005、0.013、0.012、0.046,均<0.05,可以认为淡豆豉炮制过程中细菌种类、细菌数量、霉菌数量、酵母菌数量、米曲霉数量、卵形丝孢酵母数量与GABA含量变化呈负向直线相关,枯草芽孢杆菌与GABA含量呈正向直线相关。其余菌种数量与GABA相关系数较小且无统计学差异(P>0.05),产GABA优势菌产蛋白酶、GAD能力与产GABA能力相关系数较小且无统计学差异(P>0.05)。结论1、12种微生物产酶最适p H、温度与淡豆豉自然炮制基本一致,其中真菌有较强的产GAD能力,细菌有较强的产中性蛋白酶能力,淡豆豉高富集GABA是多菌种共同作用所致。2、在淡豆豉炮制过程中产GABA的屎肠球菌、鲑色锁掷酵母菌和枯草芽孢杆菌的数量呈动态变化,淡豆豉炮制过程中GABA含量也呈动态变化,为解释微生物调控GABA形成机制提供一定的实验数据支持。3、淡豆豉炮制过程中微生物种类、数量对GABA的形成有重要影响,细菌种类、细菌数量、霉菌数量、酵母菌数量、米曲霉数量、卵形丝孢酵母数量、枯草芽孢杆菌数量与淡豆豉炮制中GABA含量显著性相关。