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研究背景和目的：肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁人的身体健康和生命安全。肺癌按组织学分类一般分为鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌,其中前三种临床常见并统称为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),约占全部肺癌的80%。肺癌患者早期一般无明显症状,当确诊时多数已经是肺癌晚期。近年,尽管以外科为主的综合治疗取得了长足的进步,但其5年存活率仍然不足15%。目前唯一能有效提高NSCLC长期生存率的办法就是做到早诊断早治疗,而要做到早诊断,明确NSCLC发生、发展的分子机制有着至关重要的作用。miRNAs是生物体内具有调控功能的一类非编码RNA(长度大约19-24个核苷酸),其主要通过与靶基因3’端非翻译区(3’UTR)结合,导致翻译抑制或mRNA降解,从而调控靶基因的表达。大量研究表明多种肿瘤组织中存在miRNA异常表达且在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,既可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性；也可作为癌基因,下调抑癌基因的活性。因此,其作为一类新的分子研究靶点已受到肿瘤等生物医学研究领域极大关注。由于RNA测序(RNA-seq)和miRNA芯片杂交方法的广泛应用,许多恶性肿瘤的miRNA表达谱得以建立,其中一些miRNA已成为肿瘤治疗的新靶点和预后的标志物。miRNA在NSCLC中的研究也越来越多,随着研究的不断深入,大量的miRNA在NSCLC中的作用得以明确。最近文献报道miR-675在人类神经胶质瘤、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中表达上调,且通过调控Cadherin13、RUNX1(Runt Domain Transcription Factor1)、Twist1(twist basic helix-loop-helix transcription factor1)等不同的靶基因参与肿瘤发生发展；而另有研究却发现miR-675在肾上腺皮质癌组织中表达下调。提示不同的肿瘤中miR-675的表达及其作用存在不同。miR-675在NSCLC中的表达情况以及是否影响其生物学特性和相关的作用机制至今未见文献报告。本项目拟采用分子生物学、细胞生物学、免疫组织化学等方法分析miR-675-5p在NSCLC癌组织中的表达水平及其临床病理意义；在此基础上,进一步探讨改变miR-675-5p的表达水平分析其对NSCLC细胞恶性生物学特征的影响以及在癌变作用的机制。为确立miR-675-5p作为抗NSCLC治疗的新靶点及预后的分子标志物提供科学依据。方法：1.收集35例临床资料齐全NSCLC病人标本(癌组织与配对癌旁组织),实时荧光定量PCR检测miR-675-5p在NSCLC癌组织及配对癌旁组织中的表达水平,分析miR-675-5p表达与NSCLC患者临床病理特征的相关性。2.构建LV-miR-675-precursor和LV-miR-675-5p-inhibition漫病毒载体并包装制备病毒(随机任意序列为阴性对照),感染NSCLC细胞A549和HTB-182,获得miR-675-5p稳定表达上调和下调细胞株,分析上调和下调miR-675-5p的表达对A549和HTB-182细胞生长增殖、侵袭迁移以及裸鼠移植成瘤等生物学方面的影响。3.生物信息学预测niR-675-5p靶基因,构建含靶基因3’-UTR的荧光素酶报告质粒,脂质体转染A549细胞和HTB-182细胞并检测其荧光素酶活性；Western杂交检测上调和下调miR-675-5p后A549和HTB-182细胞中靶基因GPR55表达水平,免疫组织化学检测上调miR-675-5p后A549细胞成瘤体后组织中GPR55表达,确定miR-675-5p是否直接作用于预测靶基因GPR55的3’-UTR且影响其表达。4非小细胞肺癌及肺正常组织芯片,免疫组织化学分析靶基因GPR55蛋白在NSCLC中的表达水平及与淋巴结转移的关系。5.构建siRNA-GR55干扰质粒转染细胞株A549-LV-miR-675-5p-inhibition,进一步分析敲降靶基因GPR55后是否阻断或降低miR-675-5p下调对NSCLC细胞A549生长增殖.侵袭迁移以及裸鼠成瘤促进作用。结果：1.miR-675-5p在非小细胞肺癌的癌组织中平均表达水平与其配对的癌旁组织相比明显下调(P<0.05),且与淋巴结转移、TNM分期成负性相关；与永生化的人正常支气管上皮细胞HBE相比,miR-675-5p在6株NSCLC细胞中的表达也明显下调(P<0.05)。2.建立miR-675-5p稳定表达上调细胞株(A549-LV-miR-675-precursor及HTB-182-LV-miR-675-precursor)和miR-675-5p稳定表达下调细胞株(A549-LV-miR-675-5p-inhibition及HTB-182-LV-miRR-675-5p-inhibition),下调miR-675-5p的表达,体外可显著促进NSCLC细胞A549和HTB-182的生长增殖、克隆形成、侵袭迁移,体内可促进移植裸鼠成瘤的生长(P<0.05)；上调miR-675-5p的表达则显著抑制NSCLC细胞生长增殖、侵袭迁移以及裸鼠移植瘤的生长(P<0.05)。3.双荧光素酶报告基因实验结果显示GPR55是miR-675-5p的直接作用靶基因,上调或下调miR-675-5p表达可以导致GPR55蛋白表达水平下调或上调。4.与永生化的人正常支气管上皮细胞HBE相比,GPR55在6株NSCLC细胞中的表达明显上调；与肺正常组织相比,GPR55蛋白在NSCLC组织中表达显著上调(P<0.05),且与肿瘤的淋巴结转移成相关。5.下调A549-LV-miR-675-5p-inhibition细胞GPR55表达后,可显著阻断miR-675-5p下调对A549细胞生长增殖、侵袭迁移及裸鼠移植瘤瘤体生长的促进作用,进一步证实miR-675-5p调控靶基因GPR55表达参与NSCLC发生发展。结论：1.miR-675-5p在NSCLC组织中的表达水平下调且与淋巴结转移、TNM分期成负相关。2.上调miR-675-5p可抑制NSCLC细胞生长增殖、侵袭迁移以及裸鼠移植瘤的生长。3.GPR55是miR-675-5p的直接作用靶基因,下调miR-675-5p表达导致靶基因GPR55表达上调促进NSCLC细胞生长增殖、侵袭迁移及裸鼠移植瘤的生长。4.GPR55蛋白在NSCLC组织中表达上调且与NSCLC的淋巴结转移成正相关。