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目的:环肽为闽产道地药材太子参中特征性成分,但其生物活性尚不明确。本课题以“柘参2号”为研究对象,建立高纯度太子参环肽提取物（CPE）制备方法;UPLC-MS/MS结合NMR表征CPE中各环肽结构;开展CPE抗肺气虚证慢性阻塞性肺疾病（COPD）的药效学验证及其对TLR4/My D88信号通路相关蛋白的调控;UPLC-MS/MS法测定CPE的吸收入血特征,通过生物素免疫印迹结合SPR实验检测其细胞膜亲和活性,探讨不同结构环肽体内吸收与细胞膜亲和力的相关性,为其后续的药物研发和应用提供科学依据。方法:1、基于HPLC指纹图谱,考察并优化环肽的提取溶剂、提取方法、提取时间及料液比,粗提物通过石油醚脱脂、水饱和正丁醇-氨试液萃取脱除氨基酸、醇沉除多糖纯化太子参中环肽类成分,建立高纯度CPE制备方法。2、采用液质联用技术（UPLC-MS/MS）,结合分子离子及碎片离子特征峰信息,探讨化合物质谱裂解规律及峰的归属;采用核磁共振波谱技术（NMR）进行环肽单体结构表征,结合~1H NMR、13C NMR、~1H-~1H COSY、HSQC、HMBC分析技术,根据一维及二维NMR中化学位移及不同元素相互间耦合关系,对环肽中质子和碳进行归属分析,确定环肽中氨基酸的组成及连接顺序,表征CPE中环肽成分的化学结构。3、烟熏法+木瓜蛋白酶雾化,建立大鼠肺气虚证COPD模型。CPE不同剂量给药,Medlab生物信号采集处理系统评价各组大鼠肺功能。肺组织切片、HE染色进行病理学观察。分离大鼠肺泡巨噬细胞（AM）,并用LPS激活,ELISA分析各组大鼠血清及AM细胞上清液TNF-α及IL-10表达量;实时荧光定量PCR测定TLR4、My D88 mRNA表达水平;Wertern blot检测TLR4下游TAK1、IKK、JNK、p38等蛋白磷酸化水平及NF-κB或AP-1蛋白表达水平。4、CPE单次灌胃给药,眼眶取血,建立血浆中环肽的液质联用测定条件,从Q-TOF-MS/MS总离子流图中提取环肽离子色谱峰,明确口服吸收入血环肽;针对其中4种峰面积较大的环肽,通过MRM模式半定量分析法测定其吸收特性。对这4种环肽单体进行生物素标记,并转印至不同磷脂模拟的细胞膜,基于免疫印迹法评价不同环肽与细胞膜的亲和力。将磷脂POPC/POPE、PI/PS、膜蛋白聚糖HSPG偶联于生物传感器芯片,表面等离子共振法（SPR）评价不同环肽与不同细胞膜受体的结合动力学特征。结果:1、基于相似相溶原理,优化了CPE提取及纯化方法,最终确定的CPE制备条件为:太子参粉末,按照1:15的料液比,以乙酸乙酯为溶剂索氏提取4h,减压回收乙酸乙酯,粗提物经石油醚多次萃取脱脂,残渣经水饱和正丁醇-氨试液萃取除氨基酸,醇沉除多糖,制备分离富集了“柘参2号”高纯度CPE。通过峰面积归一化法确定了提取物环肽成分的纯度大于90%,可用于后续研究。2、UPLC-Q-TOF-MS/MS,结合一级、二级质谱中的分子离子及碎片离子特征峰,探讨了CPE中各环肽化合物在质谱中的碎片离子归属及其裂解规律。~1H NMR、13C NMR确定了环肽中酰胺键的个数,~1H-~1H COSY、HSQC推测了环肽所含的特征片段,并结合HMBC确定了氨基酸连接顺序,表征了CPE中12个环肽类成分结构。3、药效学验证及作用机制研究表明,CPE降低肺气虚证COPD大鼠模型气道阻力,提高肺部气道动态顺应性,改善肺功能,防止炎性细胞在肺部的浸润及其对肺泡结构破坏,抑制血清及细胞上清液TNF-α的表达水平,增加IL-10的表达水平。CPE抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞TLR4、My D88 mRNA表达水平,及其下游TAK1、JNK、p38蛋白磷酸化水平和AP-1基因、蛋白表达,但对IKK磷酸化水平抑制作用不明显。4、优化了血浆中环肽的UPLC-MS/MS检测条件,确定口服吸收入血的环肽有太子参环肽甲（PA）、太子参环肽乙（PB）、太子参环肽B（HB）、太子参环肽丙（PC）、太子参环肽丁（PD）、太子参环肽A（HA）、太子参环肽戊（PE）。选取其中峰面积较大的4种环肽PB、HB、PC、PE进行半定量分析,相对于CPE提取物的吸收利用率PB＞HB＞PC＞PE,主要吸收时间在给药后前20min。生物素标记了这4种环肽单体,体外实验结果表明,模拟细胞膜对不同的环肽具有的一定的亲和性,其结合大小顺序为PB＞HB＞PC＞PE,环肽体内相对吸收率与体外模拟细胞膜亲和力大小顺序具有一致性。SPR分析结果表明,PB、HB、PC与磷脂有较强结合力,其中PB与磷脂的结和力最强,这可能是其体内吸收率最高的因素,其次是HB和PC,PE与磷脂的结合力最弱。HB、PE与HSPG有较强结合力,PB、PC与HSPG结合力较弱。结论:1、根据太子参中不同化学物质的理化性质及相似相溶原理,建立了CPE制备方法。通过峰面积归一化法确定了提取物环肽成分的纯度大于90%,可用于后续研究。2、UPLC-Q-TOF-MS/MS结合一维、二维核磁共振波谱技术共鉴定了CPE中12个环肽类成分。3、CPE可以改善COPD模型大鼠肺功能,防止炎性细胞对肺泡破坏,该药效活性可能与作用于肺泡巨噬细胞,调节TLR4/My D88/MAPK/AP-1信号通路,抑制炎症细胞因子释放有关。4、不同环肽相对吸收利用率存在一定差异。高磷脂亲和力的环肽更容易吸收入血。PB、HB、PC的吸收可能与磷脂的作用有关,HB、PE的吸收可能与膜蛋白聚糖HSPG的作用有关。环肽抗COPD的药效活性可能源于其对细胞膜的亲和作用介导的体内吸收。