论文部分内容阅读
研究背景目前造血祖细胞/造血干细胞移植(progenitor cell transplantation/Hematopoietic stem,HPCT/HSCT)主要还是静脉回输的方式,较多细胞主要沉积于肺、脾、肠和肝等髓外器官内,未能归巢至骨髓发挥其作用,因此降低了移植效率。骨髓内移植(intra-bone marrow bone marrow transplantation,IBM-BMT)使造血干细胞/祖细胞在骨髓中停留,从而促进移植细胞归巢,并提高移植效率,进而加快造血重建。但IBM-BMT对移植效果的提升仍存在争议。很大原因是由于骨髓腔内存在丰富血管网,较多经骨髓内移植的细胞仍会流入静脉系统而造成无法细胞归巢。本课题组经过多年探索建立了磁力诱导细胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation,MagIC-TT)技术。前期研究证实了 MagIC-TT 能介导骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)及造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)的靶向植入;并在自体/异体骨髓移植模型中证明了 MagIC-TT介导CD45 microbeads这种超顺磁性纳米粒子磁化的造血干/祖细胞靶向移植至小鼠骨髓能促进造血重建。在前期研究工作的基础上,本研究探讨SPIO-N-Au磁化造血细胞靶向骨髓移植的效果,研究了不同磁化细胞方式及植入细胞数量对造血重建的影响。本研究的科学假设是:MagIC-TT联合IBM-BMT介导的SPIO-N-Au磁化的造血细胞靶向移植给小鼠骨髓,通过磁场的作用,可以促使所移植的磁化细胞停留于骨髓并增殖,从而促进造血重建;不同数量造血细胞植入骨髓后,对于不同实验组小鼠的生存和造血重建有影响。本研究采用 SPIO-N-Au(superparamagnetic iron-nanoparticles-Au,超顺磁性氧化铁-纳米颗粒-金)磁化GFP转基因小鼠骨髓造血细胞后,以自体骨髓移植小鼠模型,在清髓预处理后的小鼠骨髓腔内微量注射,探究MagIC-TT联合IBM-BMT介导磁化的全骨髓细胞靶向移植至骨髓对造血重建的疗效,并以GFP报告基因标记供者细胞及半固体脱钙和病理切片等技术探究相关机制。研究目的1、在体外实验中,探讨SPIO-N-Au对磁化骨髓细胞的生物学特性影响;2、在自体骨髓移植模型中,探讨MagIC-TT+骨髓内注射SPIO-N-Au磁化的造血细胞不同细胞剂量组,对造血重建、生存率等影响及机制。研究内容第一章SPIO-N-Au对骨髓细胞的迁移及生物学特性的体外研究[方法](1)获得骨髓细胞并磁化:获取GFP+C57BL/6 供鼠骨髓细胞;以SPIO-N-Au磁化。(2)磁化细胞形态学分析及细胞活性测定:以Wright Giemsa staining、Prussian blue staining、扫描电镜和透射电镜等手段观察细胞形态及SPIO-N-Au分布;以AnnexinV-FITC/PI监测细胞凋亡揭示细胞活性。(3)磁化细胞磁力靶向迁移及定植特性:探究在外加磁场条件下,荧光显微镜下观察磁化和野生型SPIO-N-Au磁化造血细胞水平迁移及动态迁移的能力;体外培养皿中外加磁场模拟股骨局部加磁场实验,加入磁化骨髓细胞及培养基,培养24h后染色观察磁化细胞在磁场周围的定植情况。[结果](1)细胞磁化率及细胞活性:骨髓细胞磁化率为(33.5%);初始和磁化后活细胞比例(92.84±1.28%vs 89.93±1.72%,P=0.127);(2)细胞形态学分析:磁化后细胞形态学无明显差异,扫描电镜显示SPIO-N-Au能高亲和结合到细胞表面;磁化和未磁化骨髓细胞均保持细胞完整性,没有发现显着差异;(3)磁化细胞磁力靶向迁移及定植特性:在荧光显微镜下,观察到SPIO-N-Au磁化的造血细胞快速向磁场方向动态迁移,说明磁化细胞靶向迁移能力显著提高;利用自制的一种水平迁移实验体系及本课题组的半固体技术,荧光显微镜下观察到半固体内散在分布的磁化细胞,随着迁移距离延长,细胞数量、细胞分布密度对应下降。培养皿中外加磁场模拟股骨环境,加入磁化细胞及培养基,培养24h后染色观察磁化细胞在磁场周围的定植情况,染色后镜下观察结果提示磁场局部有大量骨髓细胞提留,提示磁化细胞能在磁场作用下于局部定植。[小结]体外实验中,SPIO-N-Au可以高效的磁化造血细胞,通过透射电镜等手段,观察到SPIO-N-Au可以高亲和的结合于细胞表面,磁化前后细胞活性检测无统计学差异;且电镜下观察到磁化造血细胞保持了细胞完整性;荧光显微镜观察到,在外加磁场作用下,可以实现磁化造血细胞的高速靶向迁移及水平迁移,体外股骨模拟实验提示细胞在磁场作用下可以局部大量停留、定植。第二章自体骨髓移植模型中,探讨MagIC-TT+骨髓内注射SPIO-N-Au磁化的造血细胞不同细胞剂量组,对造血重建、生存率等影响及机制[方法](1)实验分组:实验采用自体移植形式,为GFP+C57BL/6雄性小鼠供者骨髓细胞移植入普通C57BL/6雄鼠体内,根据移植细胞数量和类型,实验分成2个系列:5×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列及1×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列;在每个移植系列中小鼠随机分配到MagIC-TT,non-MagIC-TT和 Control(放疗后未处理组)三个组(n=19,17,6 VS n=13,14,3),MagIC-TT在IBM-BMT前外加磁场。(2)受鼠预处理:I放疗预处理最佳放疗致死量的实验探讨:设置多个放疗剂量组7.0Gy、7.5Gy、7.7Gy、8.0Gy,每组放疗剂量对应6只C57BL/6小鼠,分别放疗,观察21天后,比较多组放疗剂量对应小鼠的死亡情况。从而探讨受鼠的最佳放疗剂量。Ⅱ受鼠的放疗预处理:C57BL/6受鼠IBM-BMT移植前经致死性放疗及口服抗生素(左氧氟沙星)+腹腔注射抗生素(美罗培南)预防性用药。(3)IBM-BMT:本课题组自制骨穿针(Chinese Patent No.CN201620090904)行骨髓腔内细胞注射。(4)评估移植效果:以21d生存率,+5d、+8d、+10d、+12d及+18d的血常规(WBC、HGB、PLT)、骨髓和外周血eGFP+细胞比例、骨髓及脾等脏器的病理切片、PCR观察评估造血重建及移植细胞分布情况。[结果](1)小鼠最佳放疗致死剂量:以放疗剂量7.7Gy、8.0Gy放疗处理后,观察第10-12天小鼠相继死亡,死亡率均为100%;7.0Gy放疗处理后,观察21天,小鼠死亡0%;7.5Gy放疗处理后,观察21天小鼠死亡率16.7%。故本实验采用7.7Gy的放疗剂量。(2)生存率:两个系列MagIC-TT组生存率均高于non-MagIC-TT组,无统计学差异;1×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列中MagIC-TT组生存率与5×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列MagIC-TT组生存率之间并没有明显差异,甚至1×1 06 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列生存率更高。Control组10-12天内全部死亡。(3)外周血及骨髄1h eGFP+细胞比例:MagIC-TT组1h骨髓eGFP+细胞比例提示磁场作用下细胞可局部固定于小鼠输细胞侧股骨(5×106 P=0.014&1×106 p=0.001);(4)血常规:5×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列WBC(p=0.025)、HGB(p=0.003)、PLT(p=0.021)MagIC-TT 组增长数量和速度均优于non-MagIC-TT组,两者间有统计学差异;1×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列HGB(p=0.042)、PLT(p=0.049)MagIC-TT组增长数量和速度均优于non-MagIC-TT组,两者间有统计学差异,WBC(p=0.907)MagIC-TT组增长数量和速度优于non-MagIC-TT组,但两者间无统计学差异。(5)骨髓、肺、肠道及脾脏组织学:MagIC-TT组GFP+细胞主要分布在骨髓,外周少见;non-MagIC-TT组在骨髓、肺、肠道及脾脏均可观察到GFP+细胞。[小结]在自体骨髓内移植模型中,MagIC-TT联合IBM-BMT介导SPIO-N-Au磁化造血细胞靶向移植至小鼠骨髓后,观察21天,5×106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列及1× 106 SPIO-N-Au磁化的造血细胞移植系列的MagIC-TT组生存率均高于non-MagIC-TT组,两系列MagIC-TT组生存率并无明显差异,甚至低剂量组的生存率更优;输细胞侧及非输细胞侧的骨髓及外周血GFP+比例提示磁场作用下骨髓植入的磁化造血细胞可于输注侧股骨局部停留、定植,促进造血重建。血常规结果提示MagIC-TT组的WBC、PLT及HGB增长数量及速度均高于non-MagIC-TT组,但并非都具有统计学差异。