本研究分为两部分。　　 第一部分.控制性超促排卵(COH)和体外成熟(IVM)过程对卵母细胞线粒体的功能与分布影响的研究　　 目的：　　 过高的卵子损失率仍是当前人类辅助生殖技术(ART)所面临的最大问题。细胞质成熟是卵子正常受精和发育的关键，细胞质成熟不全或滞后于核的成熟被认为是ART周期卵子发育潜能低下的重要原因。在卵子成熟过程中，胞浆中线粒体发生了剧烈变化，正常的线粒体结构和功能状况是细胞质成熟的标志。ART周期中，控制性超促排卵(COH)和卵子体外成熟(IVM)过程恰好与胞浆线粒体急剧变化的时期相重合。那么，COH和IVM这两个非生理性卵子成熟过程是否会对卵子线粒体的功能状况产生影响，进而干扰细胞质成熟进程?以及COH/IVM过程对卵子线粒体功能状况的影响是否就是造成ART周期卵子高损失率或低发育潜能的重要原因?对此，本研究以小鼠为动物模型，模拟人类COH和IVM周期操作，通过分析成熟卵子线粒体的空间分布、DNA(mtDNA)拷贝数、氧化磷酸化(OXPHOS)功能，以及与线粒体功能密切相关的活性氧(ROS)水平和细胞骨架结构完整性，来评估非生理性COH/IVM过程对线粒体的数量、功能、分布及卵子质量的影响，为探索人类ART周期卵子低发育潜能和高损失率的机制提供新的思路。　　 方法：　　 将实验小鼠随机分为控制性超促排卵(COH)、体外成熟(IVM)和自然周期(NC)对照三个小组。小鼠COH和IVM培养过程尽量参照人ART周期中相应的操作方案。收集各组成熟卵子，分别检测mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量、线粒体分布、ROS水平及纺锤体与染色体结构正常率，以评估COH和IVM这两个常用ART方案对线粒体的功能状况和卵子质量的影响。　　 结果：　　 1.在COH组和NC组卵子之间，除线粒体分布和ROS水平以外，所有其它检测指标均存在着显著差异，即COH组卵子的平均mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量和纺锤体与染色体结构正常率均显著低于NC组卵子的相应指标(P<0.05)。　　 2.在IVM组与NC组卵子之间，mtDNA拷贝数、ROS水平和纺锤体与染色体结构正常率存在着显著差异，即IVM组卵子mtDNA拷贝数和纺锤体与染色体结构的正常率显著低于NC组卵子的(P<0.05)，而IVM组的胞浆总ROS水平和线粒体特异性ROS水平显著高于NC组的(P<0.05)。线粒体膜电位、ATP含量和线粒体分布在IVM组与NC组之间，无显著意义的差别(P>0.05)。　　 结论：　　 1.非生理性COH和IVM过程可显著影响卵子线粒体的功能，以及与之密切相关的ROS水平和纺锤体/染色体结构，继而可能影响卵子细胞质的成熟进程。　　 2.外源Gn刺激会显著降低COH组卵子的mtDNA的拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量和纺锤体/染色体结构正常率。　　 3.IVM过程会显著降低卵子的mtDNA拷贝数和纺锤体/染色体结构正常率，并且还会显著增加ROS的生成。但IVM过程对线粒体膜电位强度和ATP含量没有显著意义的影响。　　 4.需要进一步的研究以分析线粒体功能状况影响卵子成熟、受精和发育的具体效应和机制。　　 第二部分卵母细胞成熟过程中线粒体的氧化磷酸化和DNA复制功能对卵母细胞质量及发育潜能影响的研究　　 在卵母细胞成熟过程中，胞浆中线粒体发生了剧烈变化，而线粒体的功能被证实与卵母细胞的成熟、受精和发育潜能密切相关。但迄今为止，对于线粒体是以何种机制影响卵母细胞的质量和发育潜能仍存在着争议。有研究认为，线粒体的数量或DNA(mtDNA)拷贝数是影响卵母细胞成熟、受精和发育潜能的关键；另有研究则认为，氧化磷酸化(OXPHOS)功能才是线粒体影响卵母细胞成熟、受精和胚胎发育潜能的主要机制。　　 目的：　　 在卵母细胞成熟过程中，采用独立的线粒体功能抑制剂分别抑制线粒体的OXPHOS功能和DNA复制功能，建立线粒体功能抑制模型，分析线粒体功能抑制对卵母细胞成熟、质量、受精和发育潜能的影响，以明确线粒体对卵母细胞的影响的机制。　　 方法：　　 在小鼠体外成熟培养液中引入不同浓度的羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，10和100nM)或2’，3’-双脱氧胞苷(ddC，10和100μM)，分别抑制线粒体的OXPHOS功能和DNA复制功能。经体外14小时成熟培养，收集卵母细胞，检测各组成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度和ATP含量，以评估FCCP和ddC线粒体功能抑制模型的效果。统计卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)发生率和细胞核成熟率，分析线粒体功能抑制对卵母细胞体外成熟的影响，并通过卵母细胞线粒体的空间分布、ROS水平、纺锤体和染色体结构来评估线粒体功能抑制对卵母细胞质量的影响。最后，统计分析卵母细胞体外受精率、囊胚形成率及扩张期囊胚总细胞计数，以评估线粒体功能抑制对卵母细胞受精能力和胚胎发育潜能的影响。　　 结果：　　 1、体外添加FCCP可有效降低卵母细胞的线粒体膜电位和ATP含量(P<0.05)，但对mtDNA拷贝数无显著意义的影响(P>0.05)；添加ddC可以使卵母细胞的mtDNA拷贝数降低约50％(P<0.05)，但对线粒体膜电位和ATP含量没有显著意义的影响(P>0.05)。　　 2、FCCP处理组和ddC处理组的GVBD发生率与对照组的相比，均无显著意义的差异(P>0.05)。FCCP的10和100 nM两浓度处理组的细胞核成熟率分别为55.8％和47.3％，显著低于对照组的62.9％(P<0.05)；ddC两处理组的细胞核成熟率与对照组的相比，无显著意义的差异(P>0.05)。　　 3、FCCP的10和100 nM处理组，线粒体呈均匀分布的卵母细胞的比例分别为66.2％和54.4％，均显著低于对照组的78.2％(P<0.05)；ddC两处理组线粒体呈均匀分布的比例与对照组相比，无显著意义的差异(P>0.05)。　　 4、除FCCP100 nM处理组的纺锤体结构正常率(SP)外，FCCP处理组卵母细胞的纺锤体和染色体结构的其它检测指标均显著低于对照组(P<0.05)；除ddC10μM-组的纺锤体结构正常率(SP)和染色体正常率(CS)外，ddC处理组纺锤体和染色体结构其它检测指标均显著低于对照组(P<0.05)。　　 5、FCCP两浓度处理组的胞浆总ROS水平和线粒体特异性ROS水平均显著低于对照组的(P<0.05)；ddC处理组的卵母细胞ROS水平也有所下降，但与对照组相比，无显著意义的差异(P>0.05)。　　 6、FCCP和ddC处理对卵母细胞的体外受精能力均没有显著意义的影响(P>0.05)。　　 7、FCCP的10和100nM两处理组的囊胚形成率分别为57.8％和41.9％，ddC10和100μM两处理组的囊胚形成率分别为46.6％和37.6％，FCCP和ddC各浓度处理组的囊胚形成率均显著低于对照组的68.1％(P<0.05)，但各组扩张期囊胚的总细胞数目间无显著意义的差别(P>0.05)。　　 结论：　　 1.线粒体的OXPHOS功能和DNA复制功能抑制对卵母细胞的成熟、质量和发育均具有严重的影响，但两者对卵母细胞所产生的效应并不相同。　　 2.线粒体的OXPHOS功能抑制对卵母细胞的核成熟、线粒体的空间分布、纺锤体/染色体结构及胚胎发育潜能均产生了不利影响，但对卵母细胞的成熟启动和体外受精能力没有直接影响。　　 3.线粒体DNA复制功能抑制主要对远期的胚胎发育潜能产生影响，但对卵母细胞体外成熟、线粒体分布、ROS生成和受精能力没有显著意义的影响。