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研究背景:RON受体酪氨酸激酶因其能够转导肿瘤信号且在多种上皮细胞癌中高表达而倍受科学家的关注。目前研究已经证实,RON与乳腺癌,直肠癌及卵巢癌相关,因为这些癌细胞均高表达RON及其剪切变异体;在转基因小鼠的肺中过表达RON导致片状腺癌形成,在小鼠的乳腺组织中过表达RON不仅促进细胞癌变而且迅速发生转移,同时RON表达是无淋巴结转移的乳腺癌患者生存期缩短及早期复发的的独立预测指标。最近的研究指出,小鼠及人的胰腺癌细胞亦表达RON受体,并且从发生上皮内瘤变的胰腺细胞至原发性胰腺癌再到发生远处转移的胰腺癌细胞,随着其恶性程度的增高,RON的表达率逐渐增加。这些资料表明,RON及其变异体RON△160在人的某些恶性肿瘤的进展以及演化中可能具有重要作用;对于高表达RON及其变异体的肿瘤进行生物靶向治疗已成为可能。但是,RON及其变异体在肿瘤进展中能够介导哪些生物学行为及其机制却不甚清楚,进一步明确RON及其变异体的致瘤作用有助于全面了解这一蛋白受体在肿瘤演进中的作用,也为我们以后设计进行针对性的治疗提供一些线索。研究目的:对抗-RON单克隆抗体进行功能鉴定同时应用体外实验研究RON及其变异体在肿瘤进展中的作用及其机制。实验方法:用抗-RON单克隆抗体刺激稳定表达受体RON及其变异体的NIH3T3-RON和NIH3T3-RON△160细胞制备蛋白样品,通过Western-blot(用特异性抗体以及辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠二抗和ECL作用后在VersaDoc成像系统中成像)检测受体以及胞内癌性相关信号蛋白的磷酸化状况;应用G9、E6作用于稳定表达受体RON及其变异体的NIH3T3-RON和NIH3T3-RON△160细胞观察受体介导的致瘤活性。实验结果:研究显示G9和E6是RON受体的特异性抗体,他们对RON受体具有高度的亲和性能够用于流式细胞学检测以及受体蛋白共沉淀,在流式细胞学检测中E6与受体的亲和性高于G9而在免疫共沉淀反应中二者的作用相当。G9和E6都能够与受体的胞外域特异结合而使RON受体磷酸化而激活并使下游信号蛋白Erk1/2以及AKT等磷酸化。功能性研究显示,这两个抗体能够显著增加变异体RON△160介导的致瘤活性,包括细胞形态改变、集落形成以及运动活性增强。在诱导细胞形态改变和集落形成方面G9、E6的作用有所差异,G9诱导中到大型集落而E6诱导中小集落,而在诱导细胞形态改变方面二者作用相当,都能够使细胞-细胞间黏附消失,单个细胞形态变长。G9、E6均能够促进变异体RON△160介导的细胞运动活性增加,与培养基对照相比,G9使细胞的运动能力增加2.2倍,E6使细胞的运动活性增加1.8倍。在集落形成抑制实验中信号蛋白抑制剂PD98059能够完全抑制变异体RON△160介导导的集落形成。结论:一.抗-RON单克隆抗体G9和E6对RON受体具有高度的亲和性并且能够与受体的胞外域特异结合而使RON受体及其下游信号蛋白磷酸化;能够显著增加RON△160介导的致瘤活性,包括:诱导细胞形态改变,集落形成及运动活性增加,具有良好的配体模拟样作用,是配体MSP的有效替代者,也是我们研究变异体RON△160致瘤机制的又一有力工具。二.RON受体酪氨酸激酶及其下游Erk1/2MAPK信号通路可能在RON及其变异体介导的致瘤活性中具有重要作用。