单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人兽共患李斯特菌病的病原菌,能感染人类和40多种动物。李斯特菌病通常是由于摄入Lm污染的食物而引起的,潜伏期很长,平均2～3周,最长可超过70天,引起脑膜炎、败血症、流产或死胎等症状。该菌在环境中广泛分布,能通过污染农场环境和饲料,导致动物李斯特菌病,给畜牧业造成经济损失。携带Lm的动物经屠宰加工、运输和销售等环节最终感染人类。近年来,北美和欧洲有关动物食品污染引起的李斯特菌病暴发的报道屡见不鲜,国内由Lm引起的孕妇、新生儿和免疫缺陷患者的李斯特菌病也时有报道。该菌造成了全球经济和健康负担,对人类健康构成极大威胁。本研究调查了人李斯特菌病的流行病学现状,分析总结了李斯特菌病的临床特征和流行情况,为了解病原菌特征、传播途径、传染来源提供重要指导。此外,探究了生猪产业链中Lm的污染状况,通过基因组重测序从分子水平上分析Lm的分子特征和遗传进化关系,揭示了毒力分布及致病性,为有效控制Lm的污染和传播提供理论基础。1.2008-2017年中国人李斯特菌病报告病例分析使用计算机和手工检索2008-2017年中国人李斯特菌病的相关文献资料,对临床症状、基本资料及转归情况进行统计和分析。22个省共报告759例病例,其中包括非围产期病例245例(32%),围产期病例514例(68%)。在临床病例中,败血症是最常见的症状(49%),其次为中枢神经系统感染(25%)。总病死率为18%,其中新生儿患者的病死率高达73%。近年来,每年都有散发性李斯特菌病的报道,其中2014年达到一个患病高峰期,多集中在3月-5月。非围产期病例的平均年龄为36岁(范围为0-102岁),其中男性占多数(52%)。我国人李斯特菌病时有发生,摄入动物制品而感染李斯特菌病的病例也有报道,由此提示要加强对动物源食品中的Lm的监测,以预防和控制食源性李斯特菌病的传播。2.屠宰、运输和销售环节中单核细胞增生李斯特菌的分离鉴定从屠宰、运输以及销售环节,总共采集905份样品,包括屠宰场的9个环节663份,运输环节63份和销售环节179份,共分离到96株Lm,总分离率为10.6%。在屠宰环节未分离到Lm,在冷藏环节分离到12株Lm,分离率为10.9%,运输环节分离到11株Lm,分离率为17.5%,销售环节分离到73株Lm,分离率为40.8%。对所有分离株进行血清分型,共分为两种血清型,分别为1/2a(63.5%)和1/2c(36.5%),不同环节的优势血清型均为1/2a。屠宰,运输及销售环节中Lm的检测结果,提示Lm的污染逐级放大。对96株不同来源的Lm进行药敏实验,耐药率为90.6%。其中,临床一线药物氨辛西林(35株)及克林霉素(81株)耐药率较高,此外,57株对美罗培南耐药,18株对复方新诺明耐药,18株对四环素耐药。值得一提的是,19.5%的菌株为多重耐药。大量食源性耐药菌株的出现,提示相关部门应加强对Lm耐药性的监测,并规范动物用药。3.生猪产业链中单核细胞增生李斯特菌的分子分型研究所有Lm菌株共分为4种ST型,ST9(40株)、ST121(27株)、ST8(13株)和ST155(15株)。屠宰及销售环节中具有相同的ST型(ST155和ST9),优势ST型都为ST9和ST121,这表明Lm可沿着生猪产业链传播并发生交叉污染。基于全基因组测序的分子分型方法核心基因多位点序列分型(cg-MLST)将菌株共分为4个亚群,基本与ST型一致。不同分支上均包括同一批次屠宰场和销售环节的菌株,这说明Lm在销售环节的污染来源于屠宰场的Lm,由此提示,相较于传统分型方法MLST,cg-MLST具有更高的分辨力。基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的分型结果表明,ST121和ST155菌株有完整的CRISPR-CAS系统,将菌株聚类成11个CRISPR型,2个进化分支,正好对应2种ST型。研究发现,不同环节的相同ST型菌株的间隔序列高度和数量相同,提示Lm在屠宰场、运输和超市之间进行传播,表明了 CRISPR分型具有较好的分型能力,同时也能反映出菌株间的微进化,在Lm的追溯中具有很好的应用前景。耐药基因检测结果表明,fos(X)基因广泛分布于所有分离株中,携带dfrG基因的菌株数最多,仅一株多重耐药菌株携带fos(X)、dfrG、tet(S)、erm(B)、lnu(B)、lsa(E)和cat耐药基因,而食品分离株中同时检测到多种耐药基因尚属罕见,提示要合理使用抗生素,降低耐药性菌株出现的风险。在基于基因组重测序的基础上,我们检测了 67株不同来源Lm的82个毒力基因携带特征。其中有28.4%的分离株携带完整的毒力岛LIPI-1,未检测到携带毒力岛LIPI-2、LIPI-3和LIPI-4的菌株。此外,28.4%的分离株中均携带7个内化素家族基因,71.6%的分离株缺失actA基因。所有分离菌株均属于谱系Ⅱ,由于我国大部分临病例是由谱系Ⅱ菌株引起的,由此提示,猪肉产业链中所存在的Lm污染具有潜在地引起散发性李斯特菌病的风险,应加强对生猪产业链中Lm的监管和控制。利用单核苷酸多态性(SNP)分型方法,将屠宰、运输、销售和临床Lm菌株分为四个进化分支,其中ST9所在的A分支菌株最多。不同批次的冷藏环节中的分离到菌株处于同一分支,SNP差距为3-6个,说明这些菌株具有较近的遗传进化关系;不同批次的运输环节中分离到的菌株也聚类在同一个分支,SNP差距较小;由此提示冷藏和运输环节中的猪胴体和环境、工具之间存在交叉污染。同一分支上的不同来源的菌株之间具有高度同源性,表明Lm沿着生猪产业链进行传播;而生猪产业链中分离到的菌株与人临床分离株聚类在同二分支,提示生猪产业链中的Lm分离株对消费者存在潜在的致病风险。综上所述,我们对跨度十年的中国大陆李斯特菌病流行规律进行了探究,国内李斯特菌病以散发为主,临床症状主要为败血症,多起病例与食用猪肉食品有关。为此,本文研究了生猪产业链中不同环节Lm的分子流行病学,发现Lm沿冷藏、冷链运输和销售环节污染逐级放大;菌株呈现广泛耐药和多重耐药现象,耐药谱呈现变宽的趋势;利用cg-MLST、CRISPR和SNP等多种分型方法,揭示不同来源分离株在遗传进化上较为密切,且不同环节都存在交叉污染,具有污染食品和致病的风险。本研究对Lm的监测、预警和风险评估提供了新的认识,对于防控李斯特菌病具有重要意义。