论文部分内容阅读
禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病。它在全世界广泛存在,并引起鸡免疫抑制、肿瘤、生长发育迟缓和死亡,每年给家禽业造成巨大经济损失。迄今为止,尚无有效的疫苗或药物针对此病。ALV是一种逆转录病毒,根据致病性和抗体中和特性在鸡群中分为七个亚群（ALV-A/B/C/D/E/J/K）。虽然内源性的ALV-E不引起严重损害,因为其基因组已广泛插入宿主鸡的细胞基因组中,所以它会干扰外源ALV的测定。另外,由于外源ALV的高变异性以及新亚群、新毒株的不断出现,使得检测外源ALV变得越来越困难。目前缺乏针对ALV-A检测的单克隆抗体,而且对其抗原表位也了解甚少。本研究制备出针对ALV-A的单克隆抗体,并鉴定其抗原表位,为单抗的应用提供了科学依据,为建立ALV-A的检测方法提供了新生物材料。本研究首先利用设计的引物从ALV-A-SDAU09C1病毒的全基因组DNA中扩增gp85基因,将其插入pET-32a表达载体中,将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中,诱导表达gp85蛋白,并进行纯化。选取健康的6周龄雌性Balb/c小鼠,用纯化的gp85蛋白进行免疫,三免后取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,利用ELISA和IFA两种方法筛选出阳性的杂交瘤细胞,并克隆培养阳性杂交瘤细胞。对单克隆抗体进行ELISA效价测定、western blot鉴定。然后用同样的方法表达纯化了14段截短的重叠的gp85蛋白,利用western blot的方法,用完整的gp85蛋白作为阳性对照,鉴定抗体与gp85分段蛋白的反应性,确定抗原表位。再对初次筛选的抗原多肽截短合成,结合ELISA方法鉴定最佳线性表位。最后通过生物信息技术分析构象表位和特性,利用单抗介导的IFA分析单抗与不同亚群毒株的结合作用。结果显示,利用设计的引物成功扩增出1005 bp的gp85基因序列,在大肠杆菌中诱导表达的gp85融合蛋白大小为46 KD。利用免疫获得的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后成功筛选出一株阳性杂交瘤细胞,命名为A18GH。给小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞以使其产生腹水。通过抗体纯化柱将腹水纯化,其SDS-PAGE电泳结果显示纯度较高,并测得其抗体亚类为IgG1,测得其效价为1:210,western blot结果显示单抗可特异性结合原核表达的gp85蛋白以及在细胞中表达病毒蛋白。而后分别对分段表达的gp85蛋白和合成的多肽进行与单抗反应性的鉴定,综合蛋白的western blot结果和多肽的ELISA结果可得,其抗原表位为146-ATRFLLR-152。通过对抗原表位的空间结构分析得出,构象表位为亲水性、抗原指数和可及性均较高的一段弯曲线性结构,其在A亚群中高度保守,其次在K亚群中含有4个相同的氨基酸,而在其他亚群中同源性较低。利用IFA的方法鉴定单抗可以识别的ALV亚群,其结果显示,单抗与ALV-A-SDAU09C1毒株产生较强反应,与ALV-K-JS11C1毒株产生较弱反应,不与ALV-B-SDAU09C2和ALV-J-NX0101毒株反应。以上结果表明,成功筛选出一株分泌抗ALV-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株A18GH,并制备出ALV-A单克隆抗体,鉴定其抗原表位为146-ATRFLLR-152。