目的：随着工业化的进程、卫生条件改善、疫苗的研制和抗生素的发现,使发达国家感染性疾病的发生逐年下降,但过敏性疾病,例如支气管哮喘、变应性皮炎等的发生率却在逐年上升。支气管哮喘是一种以呼吸道高反应性和慢性炎性反应为主要特征并反复发作的变态反应性疾病,是全球最常见的慢性疾病之一。主要表现为Th1型细胞功能和数量不足,Th2型细胞反应占优势。患者的Th2型细胞可产生过多的IL-4、IL-5和IL-13,通过促进抗原特异性IgE的产生,刺激嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞增殖、分化和聚集,启动和维持哮喘的高变应性气道炎。因此,Thl和Th2型细胞之间比例和功能的失调被认为是支气管哮喘的主要免疫学发病机制,恢复二者间的平衡已成为治疗支气管哮喘的重要策略。口服益生菌被认为是改善Thl和Th2型细胞之间平衡的一种有效措施。哮喘发病机制中的卫生学假说认为,适度的微生物刺激对形成人体正常的免疫功能是必须的。益生菌是以活菌形式提供补充,通过促进肠道微生物的平衡对宿主产生友谊影响。益生菌能通过自身的代谢活动供给或促进营养物质的吸收,促进有害物质的排泄,还能通过自身的代谢,如产生大量的有机酸、分泌蛋白质等活动,阻止致病菌的侵袭,维持肠道菌群的平衡,它们是对宿主发挥免疫调节作用的主要菌群。益生菌分为三种类型：双歧杆菌、乳酸菌和兼性厌氧菌,它们对宿主有不同的作用,目前临床研究最多的是鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌。益生菌的作用机制也不同。临床实验证明,乳酸菌通过增加分泌IgA的浆细胞的数量,或改善吞噬细胞的功能,或增加T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞的数量来提高宿主的免疫功能,与对照组相比较,实验组的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平均有不同程度的降低。我们选择Lactobacillus johnsonii Ncc533 (La1)作为研究对象。口服Lal后,我们研究了从新生鼠到成年鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中IL-4和IFN-γ和血清中特异IgE水平的变化。在成年鼠中,我们建立哮喘模型,并继续研究各组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中IL-4和IFN-γ和血清中特异IgE水平的变化,希望为支气管哮喘的免疫治疗提供一条新的途径。方法1实验动物及试剂1.1实验动物健康成年BALB/C小鼠雌性20只,体质量24-28g,平均26.04g；雄性5只,体质量26-30g,平均27.86g。由山东大学医学院实验动物中心提供。雌雄4：1交配,通过观察雌鼠阴道栓确定其怀孕日期。1.2实验试剂及药物直接单抗IL-4-PE、IFN-γ-PE购自Immunotich公司,破膜剂购自Caltag公司Fix&Perm,卵清蛋白(OVA)、佛波醇酯(PMA)、离子霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)和卵蛋白粉(OVA, grade V)均购自Sigma公司,OVA特异IgE购自上海迪奥生物科技有限公司,Lactobacillus johnsonii Ncc533 (La1)悬液(1×1012CFU/L)购自雀巢研究中心。PMA贮存液：PMA溶于二甲基亚砜(DMSO),浓度为0.1mmol/ml,-20℃保存。临用前用RPMI1640(无PHA、无菌、无NaN3)稀释成50gg/L。ionomycin贮存液：ionomycin溶于DMSO中,浓度为1mg/ml,-20℃保存。临用前用RPMI1640(无PHA、无菌、无NaN3)稀释成1mg/L。monensin贮存液：ionomycin溶于甲醇中,浓度为50mg/ml,为加速溶解可置于40-43℃水浴,-20℃保存。临用前用RPMI 1640(无PHA、无菌、无NaN3)稀释2mg/L。细胞培养液(RPMI 1640):RPMI 1640液中含2mmol/L谷酰胺,50μg/ml青霉素,50μg/ml链霉素和100μg/ml新霉素。流式细胞仪为Beckman Comlter公司产品,型号为Epics-XL2分组及干预方法将孕鼠随机分为两组,每组各10只。1组为Lactobacillus johnsonii Ncc533 (La1)干预组,用Lactobacillus johnsonii Ncc533(Lal)悬液灌胃2-3周,每次2m1,每日2次。2组为无菌蒸馏水干预组,用蒸馏水灌胃2-3周,每次2m1,每日2次。仔鼠出生后,1组共生育56只仔鼠,2组共生育62只仔鼠, 1’组为1组仔鼠,2’组为2组仔鼠,各组随机抽取7只小鼠,分别分离各组小鼠的脾脏单个核细胞,备检。各组仔鼠再随机抽取20只,继续用Lal悬液和无菌蒸馏水灌胃4周,每次1ml,每日2次。4周后,各组随机抽取7只小鼠,A组为1组仔鼠, B组为2组仔鼠,分离脾脏单个核细胞,备检。在各组剩余小鼠中随机抽取7只,A’组为1组仔鼠,B’组为2组仔鼠,C’组为健康对照小鼠,选用4-6周龄的BALB/c小鼠,7只。3建立哮喘模型A’组和B’组小鼠分别于第1天和第14天致敏,每只小鼠0.2ml致敏剂溶液(20μgOVA和2mg氢氧化铝溶入0.2m1无菌PBS中)进行腹腔内注射；第21天开始激发。将小鼠置入30cm×18cm×13cm的密闭透明的玻璃箱内,以20g/L OVA PBS气雾剂雾化吸入进行激发,1次/天,20min/次,持续5天。C’组小鼠用无菌PBS进行同样操作,不予OVA激发。4各组CD4+T细胞IL-4及IFN-γ表达的检测(1)脾脏单个核细胞分离：分离1’组、2’组、A组、B组、A’组、B’组和C’组小鼠脾脏,300目钢网研磨,获得脾细胞悬液。1000r/min离心7min,弃上清。加入10ml红细胞裂解液,静置4min,再次1000r/min离心7min,弃上清,得到单个核细胞。(2)CD4+T细胞分离：每107个细胞用90μL Buffer(PBS,包含5g/L牛血清清蛋白和2mmol EDTA)重悬,加入10μL CD4+磁珠,4～8℃孵育15min,用500μL Buffer重悬。将MS细胞分离柱置于MiniMACS磁力架上,将细胞悬液通过离心柱,500μLBuffer冲洗离心柱3次,将离心柱置于合适的收集管上,吸取1mL Buffer加入分离柱内,应用配套的内芯迅速将管内液体压到收集管内,得到CD4+T淋巴细胞。(3)抗体标记：加入PMA(50μg/L)、离子霉素(1mg/L)和莫能霉素(2mg/L)刺激培养4-6h,收集细胞,2000r/min离心5min,加入破膜剂10mL,室温下避光孵育10min。加入直接单抗IL-4-PE、IFN-γ-PE,室温避光孵育30min,洗细胞1次,备检。(4)流式细胞技术检测：采用流式细胞仪分析,氢离子激发光波长400nm,各荧光通道均以相应同型IgG染色细胞为阴性对照,获取20000个淋巴细胞,计数各区的百分率。5血清OVA特异IgE检测采用ELISA技术,我们检测出各组小鼠血清中OVA特异IgE抗体水平。6肺组织病理改变分离A’组、B’组和C’组小鼠肺组织置于40g/L甲醛中浸泡固定24h,常规石蜡切片、HE染色,光镜下观察肺组织病理变化。7统计学处理采用SPSS 11.5软件,数据以x±s表示,采用t检验,p<0.05为有统计学意义。结果1.1’组和2’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4和IFN-γ水平比较1’组和2’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4水平比较无统计学差异(p>0.05),说明在新生鼠中口服Lal和无菌蒸馏水对脾脏CD4+T细胞表达IL-4水平无影响。1’组和2’组小鼠CD4+T细胞表达IFN-γ水平比较无统计学差异(p>0.05),说明在新生鼠中口服Lal和无菌蒸馏水对脾脏CD4+T细胞IFN-γ水平无影响。2.A组和B组小鼠CD4+T细胞表达IL-4和IFN-γ水平比较A组和B组小鼠CD4+T细胞表达IL-4水平比较无统计学差异(p>0.05),说明在成年鼠中口服Lal和无菌蒸馏水对脾脏CD4+T细胞IL-4水平无影响。A组和B组小鼠CD4+T细胞表达IFN-γ水平比较无统计学差异(p>0.05),说明在成年鼠中口服Lal和无菌蒸馏水对脾脏CD4+T细胞IFN-γ水平无影响。3.A’组、B’组和C’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4和IFN-y水平比较A’组和C’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4水平比较有统计学差异(p<0001),说明在哮喘小鼠中脾脏CD4+T细胞表达IL-4水平升高。B’组和C’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4水平比较有统计学差异(p<0.001),说明在哮喘小鼠中脾脏CD4+T细胞表达IL-4水平升高。A’组和B’组小鼠CD4+T细胞表达IL-4水平比较有统计学差异(p<0001),说明在Lal干预下,哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞表达IL-4水平较无菌蒸馏水组明显升高,Lal干预对哮喘有保护作用。A’组和C’组小鼠CD4+T细胞表达IFN-y水平比较有统计学差异(p<0.001)；说明哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞表达IFN-y水平降低。B’组和C’组小鼠CD4+T细胞表达IFN-y水平比较有统计学差异(p<0.001),说明哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞表达IFN-y水平降低。A’组和B’组小鼠CD4+T细胞表达IFN-y水平比较有统计学差异(p<0.001),说明在Lal干预下,哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞表达IFN-y水平较无菌蒸馏水组明显降低,Lal干预对哮喘有保护作用。4.A’组、B’组和C’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平的比较A’组和C’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平比较有统计学差异(p<0.05)。A’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平较C’组显著增加,说明哮喘小鼠造模成功,诱发了哮喘。B’组和C’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平比较有统计学差异(p<0.05)。B’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平较C’组增加,说明哮喘小鼠造模成功,诱发了哮喘。A’组和B’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平比较有统计学差异(p<0.05)。B’组小鼠血清OVA特异IgE抗体水平较A’组显著增加,说明经Lal干预后,A’组小鼠哮喘症状较B’组小鼠轻。5.A’组、B’组和C’组小鼠肺组织改变A’组、B’组HE染色镜下可见气道上皮下有肥大细胞、肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞与中性粒细胞浸润。气道粘膜下组织水肿,管腔变窄,气道分泌物增多。但B’组病变较A’组明显严重,炎性细胞浸润多,气道粘膜下组织水肿明显,气道分泌物多,管腔狭窄更明显。C’组小鼠肺组织光镜下所见正常,表现为肺泡结构清晰,支气管粘膜上皮完整。结论目前研究口服益生菌对新生鼠和成年鼠影响的报道较少。在我们的研究中发现,孕鼠口服Lal并不影响新生鼠的免疫功能。新生鼠继续口服Lal止成年,与口服无菌蒸馏水组相比较,IL-4和IFN-γ水平无统计学差异。但是在哮喘模型中,口服Lal可以明显改变脾脏CD4+T淋巴细胞表达IL-4和IFN-γ的水平和血清特异性IgE的水平,从而有利于改善哮喘的症状。