目的:人类免疫缺陷病毒HIV(Human Immunodeficiency Virus)是导致艾滋病AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome)即获得性免疫缺陷综合征的元凶。随着高效抗逆转录病毒治疗(Highly Active Anti-Retroviral Therapy,HAART)的应用,大多数感染者在经过一段时间的抗病毒治疗后,CD4+T淋巴细胞水平增加,体内HIV病毒载量降低到可检测水平以下。但是有研究报道,仍有高达30%的病人治疗后在保证良好依从性的前提下,即使血浆病毒载量能够长期控制在检测不出的水平,其免疫细胞的数量并未有显著增长,这种现象称为免疫重建不良。免疫重建不良与HIV相关并发症的发生及感染者死亡率的增加密切相关,成为艾滋病抗病毒治疗中一个亟待解决的问题。最近研究发现,HIV感染者免疫细胞的功能状态不仅与年龄、性别、病毒因素、宿主遗传因素以及治疗药物有关,而且与感染者的代谢失调密切相关。研究显示,HIV感染者T淋巴细胞功能障碍与氧化应激状态相关,且CD4+T淋巴数量与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平呈负相关。另外,HIV感染引起T淋巴细胞有氧糖酵解的增加可使细胞处于过度活化状态,炎症因子释放增加,过度的炎症反应即使通过HAART治疗也不能完全恢复。尽管已有研究表明HIV感染可带来机体的氧化应激及过度的有氧糖酵解,但是在目前WHO建议发现即治疗、扩大感染者治疗率的背景下,并没有研究系统地探讨HIV感染者在抗病毒治疗前后代谢的变化情况,从而无法评价抗病毒治疗对感染者代谢失调的影响。因此,迫切需要明确HIV感染者抗病毒治疗前后的代谢改变,寻找出与抗病毒治疗后免疫重建相关的代谢物。另外,针对氧化应激以及糖酵解引起的炎症反应,目前尚无确切的抗氧化剂可以与HAART联用提高免疫重建,且通过抑制T细胞中过量的糖酵解来降低炎症反应的治疗潜力也尚不清楚。因此,探讨代谢物在感染者中的抗炎、抗氧化作用,可为改善感染者免疫重建提供新的策略。代谢组学(Metabolomics)研究的是生物体(细胞、组织或个体等)在不同条件下产生的代谢物质的变化,可对整体代谢物轮廓进行分析,全面了解机体的代谢状态。目前用代谢组学技术寻找创新型标志物,并对特异性代谢物进行进一步分析,已在癌症、阿尔兹海默症、心脑血管疾病以及某些感染性疾病等的筛查及早期诊断中取得了重要进展。然而,目前HIV感染者代谢组学的研究十分有限,既往虽然有研究进行了HIV感染者感染、或抗病毒治疗后代谢物谱的分析,但尚缺乏HIV感染者抗病毒治疗前后代谢物变化特点的系统性纵向研究,特别是与炎症、氧化反应相关的代谢物尚未完全明确,从而无法全面地评估HIV感染者的代谢改变特点,无法系统地分析与炎症、氧化反应相关的代谢物以及明确代谢物在HIV感染过程中调节炎症、氧化反应的作用。因此,本研究拟通过代谢组学的方法,对HIV感染者抗病毒治疗前后的血浆代谢组学进行纵向研究,系统解析抗病毒治疗对HIV感染者代谢物的影响,进一步明确HIV感染者在抗病毒治疗前后体内代谢物的变化特点;寻找与免疫重建相关的炎症、氧化反应相关的关键代谢物,探讨其在体外对HIV感染者单核细胞、T淋巴细胞炎症反应及氧化应激的影响,旨在为提高患者免疫重建的治疗策略提供实验依据。研究方法:1.实验对象1.1论文第一部分收集19例HIV感染者抗病毒治疗前后的血浆标本。感染者在抗病毒治疗前不存在血脂异常,在经过至少3个月的抗病毒治疗后其病毒载量降低至400copies/m L以下。另外,我们还收集了18例健康对照者(Healthy control,HC)的血浆标本作为实验对照。1.2论文第二部分使用未治疗的HIV感染者的新鲜全血标本,提取原代CD4+T和CD8+T淋巴细胞。1.3论文第三部分使用未治疗的HIV感染者的新鲜全血标本,提取原代单核细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。2.实验方法2.1代谢组学检测2.1.1标本预处理吸取样品或者其他质控样品(包括健康血样,混合样品,水,甲醇等)100μL,转至96-孔深孔板。然后在每个含有100μL样品/质控样品的深孔内再加入含有内标的甲醇提取溶液450μL;使用封口膜封口;上下震荡2分钟,震荡后的96-孔深孔板在台式离心机上离心5分钟(2000rpm);将孔内的提取液分别转移110μL到LC-POS/NEG板,GC板和Spare板;使用氮吹仪将板内的样品吹干,存放-80度待检测。2.1.2代谢组学检测采用超高效液相色谱法/串联质谱(UPLC/MS/MS2)和气相色谱(GC)/质谱进行检测(Metabolon公司)。结果的提取分为五个部分:1)通过UPLC-MS/MS与正离子模式电喷雾电离进行分析;2)通过UPLC-MS/MS与负离子模式电喷雾电离进行分析;3)通过液相色谱平台进行分析;4)通过气相色谱-质谱平台进行分析;5)最后一份标本用于备份。应用Metaboanalyst&R.系统进行生物学信息分析。2.2原代细胞的分选密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。使用磁珠法负选PBMC中的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞;磁珠法正选CD14+单核细胞。2.3 CD4+T淋巴细胞绝对计数用EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉血,取TriTEST CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP混合染料加入到流式管中,再将全血加入,室温避光染色,随后加入溶血素,室温避光。在BD FACS Calibur流式细胞仪上进行检测,并用MultiSET软件进行计算CD3+/CD4+,CD3+/CD8+T各亚群细胞绝对数和相应百分比。2.4 HIV病毒载量检测采集研究对象全血并分离出血浆用于检测。使用美国ROCHE公司提供的COBAS AMPLICOR自动载量分析仪通过实时定量PCR测定病毒载量。2.5细胞内活性氧检测使用抗CD3/CD28刺激原代CD4+T和CD8+T淋巴细胞,加入筛选出的代谢物,共同孵育18-24小时。孵育后,加入5μM的ROS检测试剂(CellROX?Deep Red Reagent C10042,赛默飞),37℃下避光孵育30mins,PBS洗涤后,使用BD LSR II流式细胞仪和Flow Jo软件分析细胞。2.6细胞内线粒体功能检测使用抗CD3/CD28刺激原代CD4+T和CD8+T淋巴细胞,加入筛选出的代谢物,共同孵育18-24小时。孵育后,加入PE标记的100-500nM的线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)检测试剂(MP7510,赛默飞),FITC标记的20-200 nM线粒体质量(Mitochondrial mass,MM)检测试剂(MP7511,赛默飞),混匀,37℃避光孵育30mins,PBS洗涤后,使用BD LSR II流式细胞仪和Flow Jo软件分析细胞。2.7 CD4+T、CD8+T淋巴细胞活化的检测使用抗CD3/CD28刺激原代CD4+T和CD8+T淋巴细胞,加入筛选出的代谢物,共同孵育18-24小时。孵育后,实验管中加入FITC标记的鼠抗人CD25、PE标记的鼠抗人CD69和APC标记的鼠抗人HLA-DR;混匀,室温下避光孵育15分钟,加入2mL的PBS,洗涤两次,然后加入200μL的PBS悬浮细胞,使用BD LSR II流式细胞仪和Flow Jo软件分析细胞。2.8单核细胞上清细胞因子检测使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激原代单核细胞,加入筛选出的代谢物,共同孵育18-24小时。孵育后,离心收取上清,放入-80度冰箱内待检测。实验当天取出冻存标本,稀释磁珠,标准品,生物素及抗体。在96孔板中加入50μL磁珠,wash buffer洗板3次,配标准品,加入100μL标准品和上清标本(稀释2倍),高频振荡,摇床室温避光孵育40mins,wash buffer洗板3次后加入25μL稀释后的检测抗体,同样振荡室温避光孵育,wash buffer洗板3次后加入50μL的SA-PE,最后加入125μL的Assay Buffer,避光孵育后上机检测(Bio-Plex M500KCAF0Y,Bio-Rad)。2.9统计分析应用SPSS l9.0软件包以及GraphPad prism 6进行统计分析。符合正态分布的数据,采用独立样本t检验或配对t检验进行分析,不符合正态分布的数据,采用非参数检验进行分析。有显著性差异的代谢物按照fold change(FC)≥1.0的标准进行筛选,代谢组学与免疫细胞数量之间的相关性分析采用Spearman相关性分析;p<0.05为有统计学意义,0.05≤p<0.1为有边缘统计学意义;此外,在Metabolon系统里还用到主成分分析(Principal component analysis,PCA),聚类分析和随机森林分析(Random forest analysis,RFA)。结果:1.筛选出与HIV感染者免疫重建相关的代谢物1.1 HIV感染者代谢组学与正常人存在显著差异通过代谢组学检测发现,在测定的331种代谢物中,HIV感染可引起67种代谢物含量发生改变,其中脂类所占比例最大(59.7%),其次为氨基酸(26.9%)。改变的代谢物主要集中在与炎症相关的色氨酸、犬尿酸、赖氨酸,与氧化相关的N-乙酰肌肽,和与线粒体氧化供能相关的酮体,长链脂肪酸和酰基肉碱;而感染后出现改变的组氨酸既与炎症反应相关,也与氧化应激相关。1.2有效的抗病毒治疗可恢复组氨酸含量在67种HIV感染者出现异常的代谢物中,只有19种代谢物的水平在经过有效抗病毒治疗后可恢复正常。其中,参与炎症和氧化反应的组氨酸可经有效抗病毒治疗后恢复。1.3组氨酸可作为与HIV感染者免疫重建相关的代谢物在19种恢复正常的代谢物中,6种代谢物与感染者的CD4+T淋巴细胞数量呈正比:包括组氨酸(Histidine,r=0.512,p=0.001)、1-油酰-GPE(18:1)(r=0.325,p=0.046)、1-棕榈酰-GPE(16:0)(r=0.375,p=0.021)、1-花生四烯酸-GPI(20:4)(r=0.37,p=0.020),N-乙酰肌肽(r=0.335,p=0.040)和胆固醇(r=0.382,p=0.018),可能作为一组与感染者免疫重建相关的代谢标志物。其中,被认为同时具有抗炎和抗氧化作用的组氨酸可能对感染者的免疫重建起着重要的作用。2.体外实验未见组氨酸对T淋巴细胞的氧化应激有明显作用提取未治疗HIV感染者的CD4+T以及CD8+T淋巴细胞,体外不加入或分别加入2mM、20mM、50mM和100mM剂量的组氨酸孵育18-24h。结果显示,体外组氨酸的加入未见线粒体膜电位、线粒体质量及ROS产生有显著的改善。3.组氨酸在体外可降低HIV感染者的炎症反应将提取出的未治疗HIV感染者的T细胞、单核细胞体外使用组氨酸孵育。结果显示在体外加入组氨酸后,可降低CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面CD25的表达,降低单核细胞释放IP-10、白介素(Interlukin,IL)-6和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α。结论:1.HIV感染后多种代谢途径出现异常;2.与炎症、氧化反应有关的组氨酸在感染后出现异常,经抗病毒治疗后好转,且与CD4+T淋巴细胞数量呈正相关,可作为与感染者免疫重建相关的代谢标志物;3.未发现体外组氨酸的补充对于HIV感染者T淋巴细胞线粒体功能障碍及ROS产生有明显的改善作用;4.体外加入组氨酸可降低HIV感染者单核细胞促炎性细胞因子/趋化因子的释放以及T淋巴细胞的活化。