柴油机尾气(diesel engine exhaust,DEE)是柴油不完全燃烧后产生的混合污染物,成分复杂,由颗粒物成分和气体成分组成。气体成分包括碳氧化物、含氮化合物、含硫化合物和挥发性有机物等。柴油机尾气颗粒物(diesel exhaust particles,DEP)以核心元素碳为中心并吸附多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)等有机物。城市大气中细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)3%～15%来源于DEP。柴油机由于动力大、效率高、燃料经济等特点,广泛应用于交通运输、采矿和建筑工程等行业中,对于普通人群和作业人群均是可能暴露DEE的途径。柴油机试车工人即为典型的DEE职业暴露人群,工人在柴油机组装完成以后测试调整柴油机的过程中,暴露于一定量的DEE,且该作业环境中除DEE外,无其他化学性职业性有害因素。流行病学研究表明,PM2.5与人类呼吸道疾病的发病率和死亡率呈正相关。研究发现DEE暴露与肺部炎症、慢性阻塞性肺部疾病等有关。DEE中的有毒颗粒物和气体主要通过呼吸道进入机体的肺部,呼吸系统是DEE暴露的主要靶作用部位,而肺功能则可以反映肺部早期损伤,是评价呼吸系统损伤的可靠指标。虽已有人群研究报道暴露于DEE可引起肺功能指标改变,但对于DEE暴露对肺功能影响报道结果并不一致,同时,也存在混合暴露等问题,尚未见DEE单一暴露对肺功能影响的人群研究报道。C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是一种急性期反应蛋白,被认为在炎症反应中起着关键作用,可反映机体的炎症和组织损伤,在急性感染及慢性炎症如慢性阻塞性肺部疾患中均有升高,有研究发现CRP基因多态性与血清CRP水平显著相关,提示人群易感性的存在。2012年国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)将DEE重新划分为 I 类致癌物,尤其是DEE暴露引起肺癌发生风险升高,以往研究关注较多的是遗传损伤在致肺癌过程中的作用,而表观遗传学改变如微小RNA(microRNA,miRNA)等是否参与该过程,尚缺乏足够的认识。let-7家族是最早确认的miRNA之一,既往研究认为let-7家族与肿瘤、心血管疾病、炎症及细胞增殖等病理生理过程发生发展有关,尤其是与肺部疾病(肺癌、肺发育不良、肺损伤、特发性肺纤维化和肺部炎症)关系密切。因此,本研究选择某市柴油机厂137名男性柴油机试车工人作为DEE暴露组,选取同一城市某水厂127名男性水泵看护工人作为对照组。探讨DEE暴露对肺功能、CRP、let-7家族miRNA表达的影响,及其之间的相互关系。一、DEE致暴露工人肺功能改变的研究采用滤膜质量法及气相色谱质谱测定空气中PM2.5,元素碳(elemental carbon,EC),和多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)含量作为外暴露指标,工人尿中6种羟基多环芳烃(mono-hydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons,OH-PAHs)浓度采用高效液相色谱质谱法(Highperformance liquid chromatography-Mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定,作为内暴露指标。使用CHESTAC-8800便携式肺功能仪测定肺功能指标:用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值,1秒率(ratio of forced expiratory volume in 1 second to forced vital capacity,FEV1/FVC)、最大呼气中段流量(maximal mid expiratory flow curve,MMF)、呼气流量峰值(peak expiratory flow,PEF)、用力呼出25%肺活量时呼气流量(forced expiratory flow at 25%of FVC,FEF25%)、用力呼出50%肺活量时呼气流量(forced expiratory flow at 50%of FVC,FEF50%)、用力呼出75%肺活量时呼气流量(forcedexpiratory flow at75%ofFVC,FEF75%)。结果显示,PM2.5平均浓度为510.4±124.1μg/m3,EC平均浓度为144.6±44.8μg/m3,DEE暴露工人尿总OH-PAHs的浓度是非DEE暴露工人的2.77倍(12.99比4.68,P<0.001)。与非DEE暴露工人相比,DEE暴露工人的FEV1和FEV1/FVC下降(P<0.05)。与非暴露工人相比,DEE暴露工人的MMF,FEF50%,和FEF75%均下降(P<0.05)。随着尿总OH-PAHs浓度的升高,FEF75%呈降低的趋势(P<0.05),且与尿总OH-PAHs浓度呈良好的剂量-效应关系。随着工龄的增加,FEV1,FEV1/FVC,MMF,FEF25%,FEF50%,和FEF75%呈下降趋势(P-trend分别为0.015、0.002、0.001、0.024、0.004、0.001)。进一步按吸烟状态分层时,在全部研究对象、DEE暴露工人和非暴露工人均未发现吸烟对工人肺功能指标有显著性影响。二、DEE暴露工人CRP水平与肺功能改变的关联性研究采用ELISA法测定血清C-反应蛋白含量,对CRP基因单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)采用ABI TaqMan SNP 基因分型法进行基因分型。结果显示,DEE暴露工人的血清CRP水平高于非DEE暴露工人(P<0.001)。DEE暴露工人中,rs1205位点CC基因型个体及TC基因型个体的血清CRP水平显著高于TT基因型个体(P=0.011和0.004);rs3093068位点CC+GC基因型个体的血清CRP水平显著高于GG基因型个体(P=0.002);rs3091 244位点GA+GT基因型个体的血清CRP水平显著高于GG基因型个体(P=0.002),在Bonferroni多重校正后,差异仍具有统计学意义。血清CRP水平与肺功能指标的相关性分析发现,在全部工人中,FVC和FEV1与血清CRP水平呈明显的负相关(r=-0.184,P=0.003;r=-0.237,P<0.001),在DEE暴露工人中,FVC和FEV1与血清CRP水平呈明显的负相关(r=-0.310,<0.001;r=-0.342,P<0.001)。DEE暴露工人中,校正年龄、体质指数、吸烟状态和尿总OH-PAHs浓度后,rs1205位点CC基因型个体的FVC和FEV1显著低于TT基因型个体(P=0.004和0.016),在Bonferroni多重校正后,差异仍具有统计学意义;rs3093068位点CC+GC基因型个体的FVC和FEV1显著低于GG基因型个体(P=0.029和0.033);rs3091244位点GA+GT基因型个体的FVC和FEV1显著低于GG基因型个体(P=0.027和0.021),但经过Bonferroni多重校正后,未发现有统计学意义。三、DEE暴露工人let-7表达水平和肺功能改变的关联性研究采用TRIzol法提取外周血白细胞中总RNA,采用实时荧光定量PCR检测8个 let-7 家族(let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g 和 let-7i)的miRNA表达水平。结果显示,DEE暴露工人白细胞中的let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e和let-7f的表达量水平均高于非DEE暴露工人(P值分别为0.010、0.003、0.003、0.024、0.002 和 0.027)。其中 let-7b、let-7c、和 let-7e 的表达量水平在两组间差异经Bonferroni多重校正后仍具有统计学意义(P<0.01)。随着工龄的增加,let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f 和 let-7i 的表达量水平均呈显著的上升趋势(P-trend 分别为<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001和0.002),在Bonferroni多重校正后,差异仍具有统计学意义(P<0.01)。let-7的表达量与肺功能间的关联分析发现,在DEE暴露工人中,发现let-7i与FVC存在负相关关系(回归系数为-0.100,95%置信区间为-0.191--0.010,P=0.029),let-7i与FEV1存在负相关关系(回归系数为-0.092,95%置信区间为-0.177--0.001,P=0.034)。在全人群中及非DEE暴露工人中,均未发现let-7的表达量与FVC和FEV1之间的关联。结论1、DEE暴露可致肺功能下降,其中FEV1、FEV1/FVC、MMF、FEF50%和FEF75%等指标下降较为显著,表现为阻塞性通气功能变化及小气道损伤。2、DEE暴露可致血清CRP水平升高,且与肺功能呈负相关。CRP基因rs1205,rs3093068,rs3091244位点基因变异可引起血清CRP蛋白水平差异,并与肺功能改变相关。提示DEE可能通过炎性改变通路而导致肺功能损伤,CRP基因变异多态性在DEE暴露致肺功能损伤的易感性中起重要作用,可能是易感因素之一。3、DEE暴露可致外周血白细胞let-7表达水平升高,发现let-7i与FVC和FEV1存在负相关,为探讨miRNA在DEE致呼吸系统损伤中的作用提供重要的依据。