哺乳动物中,骨形成主要有软骨内成骨及膜内成骨两种方式。不同于膜内成骨,软骨内成骨是指在即将形成骨的位置形成软骨雏形,间充质细胞聚集并分化为软骨细胞,随后软骨细胞增殖、肥大分化、凋亡,最终被成骨细胞取代形成骨的过程。软骨内成骨是四肢长骨及躯干、短骨及部分不规则骨的主要骨形成方式,在胚胎发育、长骨生长、骨折修复过程中发挥重要作用。目前研究发现,FGF、BMP、PTH、Wnt等较多信号分子参与了对软骨内成骨过程的调控。成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)属于受体酪氨酸激酶家族,是软骨内成骨的负性调控分子。FGFR3功能增强型点突变可导致一系列骨骼异常遗传病,包括软骨发育不全(ACH)、季肋发育不全(HCH)、致死性发育不全(TD)等。其中,ACH是人类最常见的侏儒遗传疾病,以四肢短小,头颅短圆,前额突出,颜面中部发育不良为特征。ACH病人生长板结构异常,增殖带柱状软骨细胞排列紊乱,增殖带和肥大带缩短,生长板提前闭合。利用基因敲除及基因敲入等技术发现,小鼠敲除Fgfr3基因(R3KO小鼠)后长骨过度生长、生长板软骨细胞增殖带与肥大带显著变宽,软骨细胞增殖活性增加;而Fgfr3G369C点突变小鼠Fgfr3功能增强,小鼠个体明显变小,头颅短圆,胫骨等长骨生长板组织形态结构异常,软骨细胞的增殖带短稀,其增殖能力减弱,同时肥大软骨细胞明显减少,这些均表明FGFR3是软骨内成骨的负性调节分子。目前研究发现,除了FGFR3经典下游STAT、ERK等信号通路,其它如IHH、PTHr P、BMP与IGF等信号通路也参与了FGFR3所致软骨发育不全的调控过程。尽管如此,关于FGFR3功能增强所致的软骨发育不全的机制仍然不清楚。哺乳动物中,自噬是一种高度保守的细胞降解代谢途径。自噬广泛存在于细胞中,对机体生长发育、能量代谢、疾病免疫及肿瘤的发生发展等具有重要的生物学意义。一般而言,正常生理条件下,细胞自噬保持在一个基础水平,维持细胞正常稳态环境,而在生长激素缺乏、饥饿、缺氧、细胞内受损细胞器及代谢废物出现较多堆积等危机情况下,自噬快速上调维持细胞生存。生长板软骨细胞由于处于特殊的缺氧环境中,正常的自噬对于维持软骨细胞活性,软骨细胞正常发育有重要作用。近期研究发现受损的自噬有可能参与了Sumf1或CTGF/CCN2敲除所致的小鼠软骨发育异常,其中,软骨细胞由于丧失了自噬的保护作用而导致其细胞活性显著受抑。这些结果均提示自噬在正常软骨发育特别是四肢骨生长板软骨生成过程中发挥着重要作用。ach作为人类最为常见的侏儒遗传疾病,fgfr3功能增强导致软骨细胞活性受损(增殖受抑,分化延迟,凋亡增加),这些与sumf1或ctgf/ccn2敲除所致的软骨发育不全是相似的,提示自噬受抑有可能也参与了fgfr3功能增强所致的软骨发育不全。本研究中,我们发现ach小鼠生长板软骨细胞中自噬活性降低,利用传统或可诱导敲除fgfr3后自噬活性增加,并且我们在体外软骨细胞系中增加fgfr3蛋白水平或fgf-2处理激活下游信号通路后自噬活性受抑,这些提示fgfr3负调控软骨细胞自噬活性。我们进一步通过胚胎期骨头培养系统,利用自噬早期及晚期抑制剂(3ma与氯喹)处理胚胎期跖骨及胫骨,发现自噬受抑后抑制骨头生长,特别是软骨生成过程,阿尔新蓝染色提示自噬抑制剂处理后骨头增殖带及肥大带显著缩短。在体外软骨细胞系中,自噬抑制剂氯喹抑制软骨细胞的增殖活性及分化,与胚胎期骨头培养系统结果一致,说明自噬在正常软骨发育中发挥重要作用。自噬抑制剂对软骨生成的抑制作用与fgf/fgfr3激活所致软骨生长受抑类似,且氯喹能够缓解r3ko小鼠胚胎期跖骨的过度生长,这些均说明自噬受抑有可能是fgf/fgfr3所致软骨发育不全的机制之一。哺乳动物中,自噬是一个多环节、多步骤的代谢过程,一系列高度保守的atg(autophagy)蛋白参与了这一过程,其中atg12-atg5共价复合物是该过程的核心分子之一,其蛋白的正常表达对于自噬过程的正常进行至关重要。利用动物及细胞实验发现,干预atg5的表达(敲除、rnai或过表达)均可显著影响自噬活性。在本研究中,我们利用ach、r3ko及r3cko:cmv-creert小鼠的原代软骨细胞发现fgfr3负调控atg12-atg5复合物的蛋白水平,体外利用软骨细胞系也同样发现过表达fgfr3或fgf-2处理均可显著降低该复合物的蛋白水平。进一步我们利用免疫共沉淀等技术发现fgfr3与atg12-atg5复合物存在相互作用,且fgfr3通过激酶区(kd,kinasedomain)与atg5结合,该相互作用可被fgf-2处理激活下游信号通路后增强。通过免疫组化分析,我们发现fgfr3与atg5在小鼠生长板软骨细胞中存在表达谱的重叠,这为两者在生长板软骨细胞中发生相互作用提供了空间上的可能性。我们的实验结果显示fgfr3抑制软骨细胞自噬活性及atg12-atg5复合物蛋白水平,提示atg12-atg5复合物介导的自噬有可能参与了fgf/fgfr3所致软骨发育不全的调控过程。我们利用慢病毒在软骨细胞系中rnaiatg5后发现,软骨细胞中atg12-atg5复合物蛋白水平显著降低,自噬过程几乎被完全阻断,而且软骨细胞增殖活性及分化能力下降,与fgf/fgfr3所致软骨发育不全是相似的。并且,我们通过在fgf/fgfr3信号通路激活导致软骨细胞增殖活性及分化受抑基础上过表达atg5,发现过表达atg5能够促进软骨细胞中atg12-atg5复合物的表达及自噬活性,并且能够部分缓解fgf/fgfr3所致软骨细胞增殖及分化的受抑。这些数据不仅说明了atg12-atg5复合物介导的自噬在软骨发育中扮演重要角色,也提示其有可能参与了fgf/fgfr3所致软骨发育不全的调控过程。为了进一步验证自噬在正常软骨发育中的重要作用,我们引进了atg7条件敲除小鼠(atg7flox/flox)。虽然atg7与atg5属于不同的atg,但是两者在自噬过程中发挥着同样的不可或缺的作用,敲除或降低均会导致严重的自噬受抑。为此我们利用col2a-cre转基因小鼠,交配繁殖获得在软骨内特异性敲除atg7的小鼠。rna水平及蛋白水平提示软骨细胞中atg7显著降低,westernblotting发现突变小鼠自噬活性显著受抑。通过大体表型及组织学分析,我们发现软骨内特异性敲除atg7的小鼠四肢不成比例地缩短,同ach类似,近端肢体缩短显著。突变小鼠生长板软骨细胞增殖标志基因pcna表达降低,原代软骨细胞经诱导分化后阿尔新蓝染色较野生小鼠变浅,这些提示突变小鼠增殖及分化受抑。软骨内敲除atg7导致骨骼生长异常提示自噬在正常软骨生长发育过程中发挥着重要作用,从动物水平进一步验证了我们前期细胞及胚胎期骨头培养的结论。总的来说,我们发现自噬在维持软骨细胞正常生长发育中发挥重要作用,并且atg12-atg5复合物蛋白水平降低介导的自噬受抑可能参与了fgf/fgfr3所致软骨发育不全的调控过程,这可能为软骨发育及软骨发育不全相关分子机制提供新的理解,从而有可能为fgfr3介导的软骨发育不全提供新的治疗策略。主要研究方法:第一部分自噬在fgf/fgfr3所致软骨发育不全中的作用1.利用小鼠软骨细胞检测fgf/fgfr3对自噬活性的影响1)免疫组化检测ach小鼠及同窝对照野生小鼠胫骨生长板软骨细胞中自噬标志物lc3的表达;2)分离ach及同窝对照野生小鼠的原代软骨细胞,westernblotting检测内源lc3转换率;3)分离r3ko及同窝对照野生小鼠的原代软骨细胞,westernblotting检测内源lc3转换率;4)分离r3cko:cmv-creert小鼠的原代软骨细胞,tm处理诱导敲除fgfr3后,westernblotting检测内源lc3转换率;5)分离ach及同窝对照野生小鼠的原代软骨细胞,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光检测lc3punctation;6)分离r3cko:cmv-creert小鼠的原代软骨细胞,tm处理诱导敲除fgfr3后,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光检测lc3punctation。2.体外检测增加fgfr3表达或fgf-2处理后对自噬活性的调控1)rcs细胞中,瞬时转染fgfr3,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,westernblotting检测内源lc3转换率;2)atdc5细胞中,血清饥饿12-14小时后,fgf-2结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理30min,westernblotting检测内源lc3转换率;3)利用稳定表达gfp-lc3的hela细胞系,瞬时转染fgfr3,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光检测lc3punctation。4)利用稳定表达gfp-lc3的hela细胞系,血清饥饿及fgf-2处理,免疫荧光检测lc3punctation。3.体外检测自噬抑制剂对软骨生成过程的作用1)两种自噬抑制剂(3ma及氯喹)处理胚胎期野生型小鼠跖骨,利用内置彩色数码相机spot分别于培养0天、4天、7天对跖骨进行拍照,利用ipp6.0软件测量跖骨软骨带及矿化带长度,统计分析;2)氯喹与fgf-2处理胚胎期野生型小鼠跖骨及胫骨,利用内置彩色数码相机spot分别于培养0天、4天对跖骨与胫骨进行拍照,利用ipp6.0软件测量跖骨软骨带及矿化带长度,统计分析。在培养4天后将骨头进行固定,制备石蜡切片,阿尔新蓝染色分析氯喹及fgf-2对骨头生长板软骨细胞增殖分化的影响;3)氯喹处理r3ko小鼠胚胎期跖骨,分析自噬抑制剂对过度生长的r3ko小鼠跖骨生长的影响;4)氯喹处理rcs细胞,分别用细胞计数及mtt检测自噬抑制剂对软骨细胞增殖活性的影响;5)氯喹处理its诱导分化的atdc5细胞,通过定量pcr检测软骨分化标志基因及阿尔新蓝染色,分析自噬抑制剂对软骨细胞分化的影响。第二部分fgf/fgfr3负性调控自噬活性的相关分子机制1.fgf/fgfr3对atg12-atg5复合物蛋白水平的影响1)分离ach及同窝对照野生小鼠的原代软骨细胞,westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;2)分离r3ko及同窝对照野生小鼠的原代软骨细胞,westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;3)分离r3cko:cmv-creert小鼠的原代软骨细胞,tm处理诱导敲除fgfr3后,westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;4)rcs细胞,瞬时转染不同剂量的fgfr3,westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;5)atdc5细胞,fgf-2处理30min,westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;6)rcs细胞,瞬时转染不同激活形式的fgfr3(wt、y373c、k650m),westernblotting检测内源atg12-atg5复合物蛋白水平;2.fgfr3与atg5外源相互作用的检测1)293t细胞,免疫共沉淀检测fgfr3与atg5外源相互作用(fgfr3共沉淀atg5或atg5共沉淀fgfr3);2)293t细胞,gstpulldown检测fgfr3与atg5的相互作用;3)293细胞,yfp-pca法检测fgfr3与atg5的相互作用;4)293t细胞,mapping检测fgfr3与atg5结合domain;5)293t细胞,免疫共沉淀检测fgf-2处理对fgfr3与atg5外源相互作用的影响。3.fgfr3与atg5内源相互作用的检测1)hela细胞,瞬时转染fgfr3,免疫共沉淀检测外源fgfr3与内源atg5的半内源相互作用;2)hela细胞,免疫共沉淀检测内源fgfr3与atg5相互作用;3)野生小鼠的原代软骨细胞,免疫共沉淀检测fgfr3与atg5内源相互作用(atg5共沉淀fgfr3或fgfr3共沉淀atg5);4)免疫组化检测野生小鼠胫骨生长板fgfr3与atg5表达;5)免疫组化检测ach、r3ko小鼠胫骨生长板atg5表达。4.检测atg12-atg5介导的自噬对软骨增殖活性及分化的作用1)利用慢病毒rnai-atg5,构建稳定表达rnai-atg5的atdc5细胞系;2)定量pcr检测rnaiatg5效率;3)westernblotting检测rnaiatg5效率及对atg12-atg5复合物蛋白水平与自噬活性的影响;4)细胞计数及mtt检测rnaiatg5后对软骨细胞增殖活性的影响;5)定量pcr检测软骨分化标志基因及阿尔新蓝染色,检测rnaiatg5对软骨细胞分化的影响;6)定量pcr检测正常软骨细胞分化过程中自噬标志基因(atg5、atg12)表达;7)rcs细胞及atdc5细胞过表达atg5后对atg12-atg5复合物蛋白水平与自噬活性的影响;8)细胞计数及mtt检测过表达atg5后对fgfr3功能增强所致软骨细胞增殖活性受抑的影响;9)定量pcr检测过表达atg5后对fgfr3功能增强所致软骨细胞分化标志基因降低的影响;10)定量pcr检测过表达atg5后对fgf-2激活下游信号致软骨细胞分化标志基因降低的影响;第三部分软骨内特异性敲除atg7后对软骨生成的影响及可能的机制研究1.通过atg7flox/flox小鼠与col2a-cre转基因小鼠交配繁殖获得软骨内特异性敲除atg7的小鼠(atg7flox/flox:col2a-cre)2.检测软骨内特异性敲除atg7小鼠软骨细胞中atg7敲除效率1)定量pcr检测软骨内特异性敲除atg7小鼠的原代软骨细胞中atg7表达;2)westernblotting检测软骨内特异性敲除atg7小鼠的原代软骨细胞中atg7蛋白表达及自噬活性;3.软骨内特异性敲除atg7小鼠表型分析1)x光检测出生后突变小鼠与同窝野生小鼠大体的差异;2)x光检测出生后7天、1m、2m龄小鼠胫骨、股骨,并测量长度;3)he染色分析出生后2m小鼠胫骨生长板结构;4.探索软骨内敲除atg7致肢体不成比例缩短的可能机制1)免疫组化检测软骨内敲除atg7后对小鼠胫骨生长板软骨细胞增殖活性的影响(pcna);2)阿尔新蓝染色检测软骨内敲除atg7后对其原代软骨细胞分化的影响;3)293t细胞,免疫共沉淀检测外源atg7与外源fgfr3相互作用;4)rcs细胞,免疫共沉淀检测内源atg7与内源fgfr3相互作用;5)小鼠原代软骨细胞,免疫共沉淀检测atg7与fgfr3内源相互作用;主要研究结果:第一部分fgf/fgfr3信号通负性调控自噬活性1.fgfr3信号通路抑制小鼠软骨细胞自噬活性1)免疫组化检测ach小鼠及同窝对照野生小鼠胫骨生长板软骨细胞中自噬标志物lc3的表达,结果提示ach小鼠生长板软骨细胞lc3信号弥散,强度降低;2)小鼠原代软骨细胞,ach较同窝对照野生小鼠内源lc3转换率降低;3)小鼠原代软骨细胞,r3ko较同窝对照野生小鼠内源lc3转换率增加;4)r3cko:cmv-creert小鼠原代软骨细胞中,tm处理诱导敲除fgfr3后内源lc3转换率增加;5)分离ach及同窝对照野生小鼠原代软骨细胞,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光结果提示fgfr3功能增强后发生lc3punctation的细胞显著减少;6)分离r3cko:cmv-creert小鼠原代软骨细胞,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光结果提示敲除fgfr3后发生lc3punctation的细胞显著增加。2.体外增加fgfr3表达或fgf-2处理后抑制细胞自噬活性1)rcs细胞中,瞬时转染fgfr3,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,westernblotting结果提示fgfr3抑制内源lc3转换率;2)atdc5细胞中,血清饥饿12-14小时后,fgf-2处理结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理30min,westernblotting结果提示fgf-2激活信号通路后抑制内源lc3转换率;3)利用稳定表达gfp-lc3的hela细胞系,瞬时转染fgfr3,血清饥饿并结合溶酶体蛋白酶抑制剂(e64d+pepsa)处理4小时,免疫荧光结果提示fgfr3表达增加可抑制lc3punctation。4)利用稳定表达gfp-lc3的hela细胞系,血清饥饿及fgf-2处理,免疫荧光结果提示fgf-2激活下游信号后可抑制lc3punctation。。3.体外检测自噬抑制剂对软骨生成过程的作用1)两种自噬抑制剂(3ma及氯喹)均抑制胚胎期野生型小鼠跖骨生长,特别是软骨生长;2)氯喹与fgf-2作用类似,抑制胚胎期野生型小鼠跖骨及胫骨的软骨生长,胚胎期骨头生长板软骨细胞增殖带及肥大带长度显著缩短;3)氯喹可缓解r3ko小鼠胚胎期跖骨的过度生长;4)氯喹与fgf-2作用类似,抑制处理rcs软骨细胞增殖活性;5)氯喹与fgf-2作用类似,抑制atdc5软骨细胞分化。第二部分fgf/fgfr3负性调控atg12-atg5复合物蛋白水平,并与该复合物存在相互作用1.fgf/fgfr3降低atg12-atg5复合物蛋白水平1)小鼠原代软骨细胞,ach小鼠的atg12-atg5复合物蛋白水平较同窝对照显著降低;2)小鼠原代软骨细胞,r3ko小鼠的atg12-atg5复合物蛋白水平较同窝对照显著增加;3)r3cko:cmv-creert小鼠原代软骨细胞,tm处理诱导敲除fgfr3后,atg12-atg5复合物蛋白水平显著增加;4)rcs细胞,随着fgfr3表达剂量的增加,atg12-atg5复合物蛋白水平降低加剧;5)atdc5细胞,fgf-2处理30min显著降低内源atg12-atg5复合物蛋白水平;6)rcs细胞,随着fgfr3激活程度的提高(wt、y373c、k650m),atg12-atg5复合物蛋白水平降低加剧;2.fgfr3与atg5外源相互作用检测1)293t细胞,免疫共沉淀结果提示fgfr3与atg5存在外源相互作用(fgfr3共沉淀atg5或atg5共沉淀fgfr3);2)293t细胞,gstpulldown提示fgfr3与atg5存在相互作用;3)293细胞,yfp-pca法检测提示fgfr3与atg5存在相互作用;4)293t细胞,mapping检测提示fgfr3通过激酶区(kd)与atg5结合;5)293t细胞,免疫共沉淀结果提示fgf-2处理增强fgfr3与atg5的相互作用。3.fgfr3与atg5内源相互作用检测1)hela细胞,外源fgfr3能够免疫共沉淀内源atg5;2)hela细胞,内源atg5能够免疫共沉淀内源fgfr3;3)小鼠原代软骨细胞,内源atg5能够免疫共沉淀内源fgfr3;4)小鼠原代软骨细胞,内源fgfr3能够免疫共沉淀内源atg5;5)免疫组化检测结果提示fgfr3与atg5在野生小鼠胫骨生长板软骨细胞中的表达位置有重叠;6)免疫组化检测结果提示ach小鼠胫骨生长板软骨细胞中atg5的表达降低,而r3ko小鼠表达增加。4.检测atg12-atg5介导的自噬对软骨增殖活性及分化的影响1)利用慢病毒rnai-atg5载体,成功构建稳定表达rnai-atg5的atdc5细胞系;2)定量pcr结果提示慢病毒rnaiatg5后atg5表达显著降低;3)慢病毒rnaiatg5后atg5及atg12-atg5复合物蛋白水平显著降低,且自噬过程几乎被完全阻断;4)细胞计数及mtt检测结果提示慢病毒rnaiatg5后显著抑制软骨细胞增殖活性;5)定量pcr检测软骨分化标志基因及阿尔新蓝染色结果提示慢病毒rnaiatg5后显著抑制软骨细胞分化;6)定量pcr检测软骨分化标志基因,结果提示自噬标志基因(atg5、atg12)随着atdc5细胞分化的进行而表达增加;7)rcs细胞及atdc5细胞过表达atg5后促进atg12-atg5复合物蛋白表达,提高自噬活性;8)细胞计数及mtt结果提示过表达atg5后能部分缓解fgfr3功能增强所致软骨细胞增殖活性受抑;9)定量pcr检测过表达atg5后能部分缓解fgfr3功能增强所致软骨细胞分化标志基因的降低;10)定量pcr检测过表达atg5后能部分缓解fgf-2激活下游信号致软骨细胞分化标志基因的降低;第三部分软骨内特异性敲除atg7后骨骼生长异常,四肢骨缩短1.成功获得软骨内特异性敲除atg7的小鼠;2.软骨内特异性敲除atg7的小鼠原代软骨细胞中atg7显著降低;1)软骨内特异性敲除atg7小鼠的原代软骨细胞中atg7rna水平显著减低;2)软骨内特异性敲除atg7小鼠的原代软骨细胞中atg7蛋白水平显著减低,且自噬过程几乎被完全阻断;3.软骨内特异性敲除atg7小鼠表型分析1)大体上,突变小鼠与同窝对照野生小鼠相比无显著差异;2)7天、1m、2m龄突变小鼠胫骨、股骨较同窝野生对照小鼠缩短;3)与同窝野生对照小鼠相比,2m龄突变小鼠胫骨生长板长度变短,增殖带缩短显著;4.软骨内敲除Atg7后软骨细胞分化、增殖受抑,ATG7与FGFR3可能存在作用1)软骨内敲除Atg7后小鼠胫骨生长板软骨细胞增殖活性下降(PCNA免疫阳性颗粒减少);2)阿尔新蓝染色提示软骨内敲除Atg7后原代软骨细胞分化受抑;3)293T细胞,免疫共沉淀结果提示ATG7与FGFR3存在外源相互作用;4)RCS细胞,免疫共沉淀结果提示ATG7与FGFR3存在内源相互作用;5)小鼠的原代软骨细胞,免疫共沉淀结果提示ATG7与FGFR3存在内源相互作用。主要结论1.FGF/FGFR3信号通路负性调控软骨细胞自噬活性;2.自噬抑制剂通过抑制软骨增殖活性及分化抑制软骨生成过程;3.FGF/FGFR3信号通路负调控ATG12-ATG5复合物蛋白水平;4.FGFR3与ATG12-ATG5复合物存在相互作用,并通过激酶区与ATG5结合;5.ATG12-ATG5介导的自噬在软骨发育特别是对软骨细胞增殖、分化有重要作用;6.过表达ATG5可部分缓解FGF/FGFR3所介导的软骨细胞增殖分化受抑;7.软骨内敲除Atg7后小鼠四肢长骨呈不成比例缩短,近端肢体缩短显著,这与ACH是相似的。