猪是一种有着广阔应用前景的理想动物模型。卵母细胞体外成熟、孤雌激活及胚胎体外培养构成一套有效的体外繁殖技术,可以有效解决目前猪胚胎体外生产效率不高等问题。卵母细胞和胚胎冷冻保存是一种有效保护动物遗传资源的方法,利用简便快速的玻璃化冷冻保存技术,可以建立雌性动物基因库、保存珍稀生物资源,为其保护和保存提供了不受时间和地域限制的新途径。本研究对影响猪卵母细胞体外成熟培养、孤雌激活、玻璃化冷冻保存的因素进行了研究,以便确立胚胎体外生产的最佳条件以及冷冻保存方法。1.猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活研究本试验以屠宰场采集的猪卵巢卵母细胞为研究对象,旨在优化猪卵母细胞体外成熟培养体系及孤雌激活方法。以抽吸法采集猪卵巢中直径为2～5mm及直径大于5mm卵泡卵母细胞,在成熟培养液为TCM-199(含10%FCS)+pFF+PMSG+hCG+EGF+L-半胱氨酸中培养44 h.培养成熟,用透明质酸酶去除卵丘细胞后进行孤雌激活。结果表明：当电激强度由80V/mm增大至140V/mm时,死卵数逐步增加。当电压为120V/mm时,卵裂率(58.04%)和囊胚率(16.96%)最高。继续增大电压表现为对卵母细胞的副作用增大。在电脉冲时间上,40μs组卵裂率(65.79%)和囊胚率(20.18%)最高,且显著高于20μs组(P<0.05)。增加电脉冲次数并没有能提高卵裂率和囊胚发育率,反而使得死卵数有所增加,其中三次电脉冲后孤雌胚的发育能力明显低于其它的处理组(P<0.05)。电激活后与不同的化学激活剂联合处理,可提高孤雌激活效率。DC pulse+CHX+6-DMAP组卵裂率和囊胚率最高,达90.4%和35.6%。联合激活虽没有显著提高电激活后卵裂率(P>0.05),但与单独使用电激活相比,囊胚率有了显著提高(P<0.05)。2.猪卵母细胞的玻璃化冷冻技术研究本实验使用3种不同冷冻载体(OPS法、细管法和冷冻环法),用于猪未成熟(GV期)和体外成熟(MII期)卵母细胞的冷冻保存,比较其冷冻效果。同时,对CB和紫杉醇处理在卵母细胞冷冻中的作用进行研究。结果表明,GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存后,不同冷冻载体冷冻-解冻后卵母细胞的形态正常率无显著差异(P>0.05)。冷冻环法冷冻卵母细胞FDA染色存活率最高(82.00%),OPS法(72.00%)次之,细管法最低(58.00%)；冷冻环法冷冻明显优于OPS法和细管法(P<0.05)。在冻后卵母细胞体外成熟率方面,冷冻环法获得51.54%的成熟率,显著高于细管法和OPS法(分别为28.57%和42.86%,P<0.05)。3种冷冻载体对MII期卵母细胞冻后的形态正常率也无显著影响,分别为84.18%、80.63%和70.92%,P>0.05。从FDA染色存活率来看,冷冻环法最高,OPS法次之,细管法最低,且三者之间差异显著(P<0.05).使用紫杉醇预处理后,比较其对冷冻环冷冻效果的影响。结果显示使用1.0μmol/L紫杉醇预处理卵母细胞,冷冻后其形态完整率(89.93%)和FDA染色存活率(83.33%)都显著高于未处理组的79.12%和70.97%(P<0.05),继续提高紫杉醇浓度则表现为对卵母细胞的毒副作用。在不同预处理时间上,预处理30min组冷冻后卵母细胞形态完整率和FDA染色存活率最高,分别达到90.21%和84.13%。预处理浓度1.0μmol/L,30min是比较合适的处理方法；紫杉醇、细胞松弛素B(CB)或两者联合添加能显著提高猪成熟卵母细胞的玻璃化冷冻的效果(P<0.05),但两者之间没有显著差异(P>0.05)3.猪卵母细胞玻璃化冷冻后超微结构的变化本试验旨在研究猪未成熟(GV期)和体外成熟(MII期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化。透射电镜观察结果表明,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻解冻后,卵母细胞外侧透明带破损；卵母细胞与卵丘细胞间的连接遭到破坏,部分卵丘细胞脱离；卵丘细胞之间的连接也遭到破坏；微绒毛数量减少且变短；卵母细胞内的脂滴都为平滑型,未见表面粗糙带有透明条纹的脂滴。MII期卵母细胞经玻璃化冷冻解冻后,透射电镜观察结果显示,冷冻后细胞内仅能看到平滑性脂滴,且结构遭到破坏、部分脂滴破损；线粒体呈簇状伴随脂滴存在于胞质中,但结构模糊,基本看不到其内的嵴结构,且出现很多空泡；皮质颗粒未成线性排列在质膜下。