角膜混浊发病率高、治疗困难,是当今世界致盲的主要原因之一.目前主要治疗方法是板层或穿透性角膜移植,但受到了角膜供体来源缺乏、供体老龄化以及术后免疫排斥反应等限制.利用新兴的生物工程和组织工程技术在体外构建出生物角膜以替代供体角膜移植,以及体外培养角膜内皮细胞移植以治疗角膜内皮失代偿疾病,成为当前研究的热点和难点.本研究设计以脱细胞基质为支架,在生物反应器中培养全层生物角膜;同时以羊膜基底膜为载体培养角膜内皮细胞进行移植. 目的： 以异种角膜脱细胞基质为载体支架,探索生物反应器内组织工程化角膜的体外构建的技术和方法.以羊膜基底膜为载体培养角膜内皮细胞,体外构建角膜内皮层进行兔角膜后板层内皮移植实验,为角膜内皮层移植提供新的方法. 材料和方法: 1.机械分离兔角膜上皮层、基质层和内皮层,联合应用组织块法和消化法获得原代角膜细胞,细胞生长融合后进行传代培养,并对三种细胞分别进行免疫细胞化学检测. 2.体外制备猪角膜脱细胞基质和几丁糖载体,分别种植培养的角膜基质细胞进行基质层的构建,同时将两种载体材料移植到兔角膜基质板层囊袋中观察其生物相容性. 3.将绿色荧光蛋白(GFP)标记的角膜基质细胞种植于脱细胞基质载体内部,生物反应器内培养获得基质层,内外表面分别种植角膜内皮细胞和上皮细胞,继续在生物反应器内培养全层角膜,对其结构和特性进行检测. 4.以羊膜基底膜为载体培养兔角膜内皮细胞,对切除后板层的兔角膜进行移植,以无培养细胞的羊膜移植和单纯角膜后板层切除为对照,术后观察角膜透明度及厚度,并进行组织学检测. 结果： 1.体外培养的兔角膜上皮、基质和内皮细胞生长良好,增殖旺盛,可连续传代培养扩增;上皮细胞表达其特异性角膜白CK3、基质细胞波形蛋白表达阳性、内皮细胞表达水通道蛋白AQP1. 2.角膜脱细胞基质载体具胶原板层结构,体外构建的基质层与正常角膜相似,生物相容性良好;几丁糖网状纤维结构疏散,移植后降解快,但产生明显的炎症和排斥反应. 3.GFP标记的角膜基质细胞镶嵌在载体支架内,形成三维结构的基质层;生物反应器内培养的角膜组织具复层上皮,板层基质和单层内皮层,与正常角膜结构相似;各层细胞表达其细胞表面标志. 4.角膜内皮细胞在羊膜基底膜上融合成单层;培养内皮层移植后角膜维持相对的透明及薄度,而两对照组角膜严重水肿、混浊,厚度皆明显高于实验组角膜,三组比较有显著性差异. 结论： 1.联合应用组织块和酶消化法获取纯度高、活力好的原代细胞,体外培养可获连续传代扩增,各细胞表达其细胞表面标志. 2.异种角膜脱细胞基质在形态、结构以及生物相容性上比几丁糖网状纤维更适于作为体外构建生物角膜的载体支架,而几丁糖材料则需要进一步改进. 3.角膜脱细胞基质是构建生物角膜的良好载体,通过分别种植角膜基质、内皮和上皮细胞,在生物反应器中动态培养,可在体外构建出近似正常组织结构的全层生物角膜. 4.羊膜基底膜可促进角膜内皮细胞的生长和增殖,体外重建角膜内皮层进行后板层移植,有望代替供体穿透性角膜移植治疗角膜内皮失代偿.