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【研究背景】附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护的重要器官。附睾管腔的低钙环境可以维持精子静息状态,防止精子提前激活。附睾管腔钙离子浓度异常升高将导致精子过早活化,精子运动功能降低,甚至雄性生育缺陷或不育,然而附睾管腔钙稳态的调节机制尚未被充分阐明。维生素K2(vitamin K2,VK2)循环依赖的γ-谷氨酰基羧化酶(γ–glutamyl carboxylase,GGCX)与其底物基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)在血管、肾脏等组织局部的钙稳态调节中发挥重要作用。MGP在VK2充足的条件下被GGCX羧化激活后可与钙离子或钙晶体结合,防止组织局部游离钙浓度过高和钙盐沉积。为探究这种重要的钙稳态调节是否在附睾低钙环境的维持中发挥作用,本实验首先检测了VK循环相关分子在WT大鼠附睾中的表达和定位,然后通过构建华法林诱导的VK2缺乏大鼠模型,观察在VK2循环被抑制后大鼠生育相关表型的改变及附睾组织和附睾液钙含量的变化,最后在不育的弱精症患者中检测GGCX和MGP外显子的SNP位点,进一步探究GGCX和MGP对男性生育功能维持的临床意义。【研究方法】1.采用实时定量PCR检测VK循环相关分子VKORC1,GGCX,MGP在大鼠附睾,睾丸和肾脏等器官的表达。通过Western blot和免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术,观察GGCX和MGP在大鼠附睾组织中的表达定位情况。2.通过Western blot检测MGP与其潜在结合蛋白在不同钙离子浓度的附睾和肾脏组织匀浆中的结合能力,并利用蛋白胶内酶切与LC-MS/MS检测和生物信息学分析,筛选出MGP的潜在结合蛋白可能参与的信号通路。3.通过皮下注射华法林和VK1来构建VK2缺乏大鼠模型,观察大鼠体重和肝肾等重要脏器重量的变化。采用交配实验和计算机辅助精子分析(computer assisted semen analysis system,CASA)检测大鼠生育力和精子运动能力的改变,并收集精子进行涂片,通过IF技术在共聚焦显微镜下观察统计大鼠精子形态变化。4.采用苏木精伊红染色(hematoxylin and eosin staining,H&E)观察VK2缺乏大鼠附睾上皮形态变化,并利用IF技术分别标记附睾上皮主细胞和亮细胞的特异性标志物E-caherin和B1-V-ATPase及细胞骨架蛋白Phalloidin;同时观察GGCX和MGP的定位情况。此外,还利用TUNEL染色检测大鼠附睾上皮及管腔内凋亡信号,综合分析大鼠附睾上皮形态和功能的改变。5.通过X射线荧光光谱分析(X-ray fluorescence imaging,XRF)技术检测附睾组织冰冻切片钙离子分布情况,并利用电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)分析各组大鼠附睾液中钙离子相对浓度的改变。此外,利用IF检测大鼠附睾MGP羧化水平的变化。6.对199例不育的特发性弱精症患者和110例生育能力正常的对照组的血液样本进行高通量测序检测GGCX和MGP全外显子的SNP位点。基于R语言对检测出的SNP位点进行关联分析,筛选出具有统计学意义的突变。【研究结果】1.VK循环相关分子GGCX,MGP,VKORC1均在大鼠附睾中有表达,其中MGP在附睾中的表达显著高于睾丸、肾脏等器官。GGCX和MGP均在附睾头部开始有表达,在附睾体部和尾部表达量较高。二者的共定位主要集中在附睾体部和尾部的上皮细胞及管腔中的囊泡状结构,而在起始部和头部的共定位不明显。2.在WT大鼠肾脏和附睾组织中,MGP均在低钙离子浓度环境形成~32 k Da大小的蛋白复合体,随着钙离子浓度升高,蛋白复合体形成受阻。LC-MS/MS结果显示,该蛋白复合体中除MGP外,还含有ESCRT和Rab蛋白家族的分子。3.VK2缺乏大鼠的体重和重要脏器的重量/体重比与对照组相比无明显差异,但生育力和精子运动能力明显降低,降低程度与华法林给药剂量相关。此外,VK2缺乏大鼠精子颈部弯折、头部离断等异常形态比例显著增高,但其睾丸的生精功能未受明显影响。4.VK2缺乏大鼠附睾管腔中可见脱落的上皮细胞,附睾基底部的平滑肌细胞骨架受损,主细胞和亮细胞标志物表达减弱,管腔脱落的细胞及细胞碎片内可见亮细胞标志物信号,且管腔内可见凋亡信号。5.VK2缺乏大鼠附睾上皮钙含量明显升高,附睾液中钙浓度升高,附睾MGP羧化水平降低。6.测序结果显示,特发性弱精症患者GGCX第8个外显子中rs699664位点的突变在隐性模型下分析具有统计学差异。MGP未发现有统计学差异的突变位点。【研究结论】1.VK循环相关分子在大鼠附睾的高表达提示VK在大鼠附睾的微环境调节中扮演重要角色。GGCX和MGP的共定位结果表明,二者协同在大鼠附睾的体部和尾部发挥重要作用。2.MGP蛋白复合体的聚集受钙离子浓度影响,与MGP潜在结合的蛋白可能参与囊泡运输、跨膜转运等生物学过程。3.VK2缺乏大鼠的生育力和精子运动能力显著减弱,附睾尾部精子数量降低及精子形态异常比例显著增加,但睾丸生精功能未受影响,这提示VK2缺乏对大鼠生育功能的影响主要发生在附睾而不是睾丸。4.VK2缺乏大鼠上皮细胞脱落,附睾基底部的平滑肌细胞骨架受损,管腔内出现凋亡信号,附睾上皮主细胞、亮细胞标志物表达降低,表明VK2缺乏大鼠附睾上皮细胞功能受损。5.VK2缺乏大鼠附睾上皮和附睾液中钙含量均显著升高,且MGP羧化水平随之降低,提示VK2的缺乏导致大鼠附睾低钙微环境发生改变,VK2通过调控MGP羧化状态维持附睾管腔钙稳态。6.不育的弱精症患者中GGCX的rs699664位点突变频率高,提示该位点的突变可能是弱精症的潜在病因之一,也进一步验证了VK循环和VDP对男性生育功能有重要影响。