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流感病毒是引起呼吸道感染的主要病源，属于分节段的RNA病毒。该病毒突变率高、易重组，能够感染人、禽、猪等多种宿主，严重威胁人类健康。据世界卫生组织统计，每年全球有上百万例流感重度感染，死亡人数约50万。特别是近年来反复出现禽流感病毒跨种族感染人的病例，死亡率更是高达30％-50％,因此，流感是当今世界最为严峻的公共卫生问题之一。接种疫苗是预防流感最经济有效的手段，然而现有的流感疫苗仅对特定毒株有效，对于抗原不匹配的毒株保护效果较差。因此，新型、高效的广谱流感疫苗成为疫苗研究领域的热点。 腺病毒载体是目前应用前景最广的疫苗载体之一。它可以感染分裂和非分裂的细胞，高效介导外源基因的表达并刺激机体产生强烈的免疫反应，不整合进基因组，体外易于制备。因此，腺病毒载体被广泛应用于各种疫苗研发。本研究中，我们选取人群血清阳性率较低的黑猩猩腺病毒为疫苗载体，以不同策略研发新型广谱流感疫苗。 在第一部分研究中，我们选择流感病毒中高度保守的M2e为抗原，将来自三株不同流感病毒的M2e表位表达在黑猩猩腺病毒纤突蛋白(Fiber)的HI loop中，以此增强M2e免疫原性。我们采用等温重组法将长达225个碱基的外源基因连入AdC68结构蛋白中，得到AdC68-F3M2e。该片段的插入并不影响纤突蛋白的三聚化，并可在腺病毒颗粒表面展示。此外，其中一株重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)，在BALB/c小鼠中经过两次肌肉免疫，可引起M2e特异的抗体反应，并对同源的H1N1和异源的H9N2、H5N1流感病毒攻击感染产生有效的保护。 在第二部分研究中我们将RNA干扰技术应用于流感防控。核蛋白(NP)和基质蛋白(M1、M2)在流感病毒中相对保守，我们以此为靶基因，筛选具有抑制流感病毒复制能力的人工合成microRNA，并以腺病毒作为转运载体，高效介导小RNA的表达，以此作为一种新的抗流感策略。我们发现特异性靶向NP、M1和M2的人工合成microRNA可以在HEK293、MDCK上有效的抑制流感生长。不同amiRNA在细胞内表达量接近，抑制效率的差别由其本身决定。以1011vp的AdC68-amiRNA接种小鼠，对同源的A/PR8流感感染具有100％的保护效果，对于异源的H5N1和H9N2也有部分保护。 由于我们证明了腺病毒载体介导的人工合成microRNA作为新型广谱疫苗的可行性，因此，在第三部分研究中，我们进一步尝试用以上策略拮抗不同进化枝(clade)H5N1的复制。H5N1病毒的血凝素基因与其致病性密不可分，影响病毒组织分布、抑制免疫反应等。我们以血凝素为靶基因，设计并构建了重组腺病毒，其中HA-1405在细胞水平可抑制96.7％的clade2.3.2H5N1生长。经rAd(HA-1405)免疫的小鼠在不同进化枝H5N1攻击感染后，症状显著缓解，肺部病毒滴度下降3-40倍不等。rAd(HA-1405)对clade2.3.2和clade2.3.4分别有70％和40％的保护效果。 综上，本研究证明腺病毒纤突蛋白呈递多个流感病毒M2e表位和腺病毒转导靶向流感的人工合成microRNA均为流感病毒防控的有效手段，为新型广谱流感疫苗的研发提供了新策略。