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宫颈癌由于具有高发病率、高侵袭性和高转移性以及逐渐趋于年轻化的特点,已成为世界范围内妇女的第二大恶性肿瘤。宫颈癌患者的预后与其分期密切相关,对于浸润转移者来说,其预后相对较差,而肿瘤局限者的预后则相对较好。越来越多的研究表明在宫颈癌的发生过程中,高危型人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是其发生发展的重要条件,但并不是所有感染高危型HPV的妇女均会发展为宫颈癌,由此我们可以推测宫颈癌的发生还有其他一些因素的共同参与。对于预后较差的宫颈癌患者来说,通常与骨盆淋巴结的受累相关,可能是肿瘤细胞已经发生了转移。在肿瘤细胞发生侵袭和转移的过程中,癌症细胞破坏了基底膜的基本功能,使得单个的或成组的癌症细胞获得了侵入邻近间质细胞的功能。在发生此过程的初始阶段,极化的上皮细胞获得了间充质细胞的特性,发生上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。EMT在肿瘤的传播和转移扩散中发挥重要的作用。但是目前关于宫颈癌细胞是如何获得侵入周围组织和转移的能力的,还不清楚,且EMT在宫颈癌细胞和组织的作用还是鲜为人知的。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF),是前炎性细胞因子的一部分,在多种疾病的病理损伤过程发挥着重要的作用,研究表明MIF基因调控的蛋白在多种癌症中呈现高表达状态。本课题组经过前期的实验研究证实MIF在宫颈癌Si Ha细胞株中呈现相对较低的表达水平,而相对于宫颈癌Caski细胞株来说,MIF的表达则最高,且后续的研究在细胞水平证实过表达MIF可以促进宫颈癌Si Ha细胞EMT的发生,促进其侵袭和转移的发生。国外有学者研究证实过表达MIF的表达水平后,可以促进胰腺癌细胞EMT的发生,促进其侵袭和转移;而RNA干扰沉默MIF的表达水平后,可以抑制胰腺癌细胞EMT的发生,降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,但MIF能否诱导宫颈癌细胞发生EMT,尚未见报道。目的:1、在蛋白水平进一步探讨过表达MIF对宫颈癌Si Ha细胞中MIF蛋白质表达的影响,并进一步检测宫颈癌Si Ha细胞中EMT相关标志物E-cadherin,Snail,Twist和Vimentin蛋白质的表达变化;2、应用RNA干扰技术,将宫颈癌Caski细胞中的MIF沉默后,探讨宫颈癌Caski细胞MIFm RNA和蛋白质表达的变化,并进一步检测上述4种EMT相关标志物m RNA和蛋白质的表达变化。方法:1、分别构建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIF si RNA真核表达载体,同时还有其阴性的对照质粒p EGFP-N1和p Genesil-1,构建完成后对各组进行提取质粒;.2、培养宫颈癌Si Ha细胞系和宫颈癌Caski细胞系;3、采用脂质体转染法将质粒p EGFP-N1-MIF和p EGFP-N1转染至宫颈癌Si Ha细胞,而质粒p Genesil-MIF si RNA和p Genesil-1转染至宫颈癌Caski细胞,转染后对各组细胞的转染情况在倒置荧光显微镜下进行观察;4、将Si Ha细胞和Caski细胞分别作为各组别的空白对照组。对于Si Ha细胞组来说,在前期课题组研究的基础上,使用蛋白质印迹法(western blot)检测各组中MIF蛋白表达的变化以及各组中EMT的相关基因蛋白的表达情况:E-cadherin、Snail、Twist和Vimentin;对于Caski细胞组来说,首先采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测各组中MIFm RNA及蛋白表达的变化,之后进一步检测各组中EMT以上四种相关基因的表达情况。结果:1、在倒置相差显微镜下,可以看到Si Ha细胞株和Caski细胞株的生长情况均比较旺盛;2、成功构建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIFsi RNA真核表达载体以及各自的阴性对照质粒p EGFP-N1和p Genesil-1;3、在转染后6小时,即可在倒置荧光显微镜下观察到真核表达载体p EGFP-N1-MIF/Si Ha和p Genesil-MIF si RNA/Caski呈现绿色荧光,之后逐渐增强,到48小时时达到高峰,其后逐渐减弱,且越来越弱;4、对于Si Ha细胞组来说,通过Western blot法检测证实,相对于阴性质粒组(转染p EGFP-N1质粒)和空白对照组(Si Ha细胞)来说,实验组(转染p EGFP-N1-MIF质粒)MIF蛋白的表达要高于各对照组(P<0.05),而与空白组相比,阴性质粒组的MIF蛋白的表达与之相比两者之间无明显差别(P>0.05),由此推测阴性对照组质粒并不会对Si Ha细胞中的MIF蛋白产生影响;5、对于Caski细胞组来说,通过RT-PCR法和Western blot法检测证实,相对于阴性质粒组(转染p Genesil-1质粒)和空白对照组(Caski细胞)来说,实验组(转染p Genesil-MIF si RNA质粒)MIFm RNA及其蛋白的表达低于各对照组(P<0.05),而与空白组相比,阴性质粒组的MIFm RNA和蛋白的表达与之相比两者之间无明显差别(P>0.05),证明阴性对照组质粒并不会对Caski细胞中的MIFm RNA和蛋白产生影响;6、与EMT相关指标的检测:对于Si Ha细胞组,p EGFP-N1-MIF转染Si Ha细胞后,与对照组相比,上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平下调(P<0.05),间叶标志物Vimentin,Snail和Twist蛋白表达水平显著上调(P<0.05),而p EGFP-N1质粒组和空白Si Ha细胞组相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist蛋白的表达均无明显变化(P>0.05);对于Caski细胞组来说,p Genesil-1-MIFsi RNA转染Caski细胞后,与对照组相比,上皮标志物E-cadherin m RNA及蛋白表达水平上调(P<0.05),间叶标志物Vimentin,Snail和Twist m RNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.05),而p Genesil-1质粒组和空白Caski细胞组相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist m RNA和蛋白的表达均无明显变化(P>0.05)结论:1、过表达宫颈癌Si Ha细胞中的MIF后,上皮细胞的间质化水平相应的增高:上皮特征性标志物E-cadherin的表达水平降低,间充质标志物Vimentin,Snail和Twist的表达水平升高;2、当沉默宫颈癌Caski细胞中MIF的表达水平后,上皮细胞的间质化水平相应的降低:上皮特征性标志物E-cadherin的表达水平升高,间充质的标志物Vimentin,Snail和Twist的表达水平降低;3、MIF的过表达可以促进宫颈癌细胞EMT的发生;而MIF沉默后可以抑制宫颈癌细胞EMT的发生。