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背景及目的肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占 80%,五年生存率低,仅为 8-10%。近年来,肺癌分子靶向治疗在临床应用日趋成熟,其中以吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的应用最为广泛,在NSCLC治疗方面取得了突破性进展。但几乎所有患者治疗一段时间(中位时间为9～14月)后逐渐对EGFR-TKI不敏感,出现获得性耐药,有少数携带敏感突变的患者在初始治疗阶段对药物不敏感,即为原发性耐药。肿瘤耐药已成为NSCLC靶向治疗面临的严峻问题之一,极大限制了 EGFR-TKI的应用,故探讨EGFR-TKI的耐药机制、寻找逆转耐药的新策略已成为研究热点。越来越多研究报道,表观遗传学在肿瘤耐药方面扮演重要角色,而RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)修饰是表观遗传学研究的前沿领域和热点,其在非小细胞耐药中的研究还未见报道。本文旨在研究m5C甲基转移酶NSUN2在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用,为逆转EGFR-TKI耐药提供新策略。方法1.利用TCGA、GEO数据库分析肺癌组织与正常组织中NSUN2的表达情况以及NSUN2的表达水平与肺癌预后的关系。2.收集临床肺癌患者的癌与正常组织样本,利用Western blot、Q-PCR等实验进一步验证肺癌患者中NSUN2的表达情况。3.收集EGFR-TKI敏感患者的肺癌组织样本和EGFR-TKI原发性耐药患者的肺癌组织样本,利用免疫组化从临床水平分析敏感患者与原发性耐药患者组织中NSUN2的表达情况。4.收集EGFR-TKI原发性耐药患者服用吉非替尼前和服用吉非替尼后的肺癌组织样本,利用免疫组化和免疫荧光实验从临床水平分析吉非替尼对原发性耐药患者NSUN2表达水平影响。5.以EGFR敏感突变的NCI-H1650细胞作为EGFR-TKI原发性耐药细胞模型,利用克隆形成实验、划痕实验、transwell实验以及流式细胞术分析NSUN2对耐药细胞的细胞增殖、细胞迁移和侵袭、细胞周期阻滞、细胞凋亡的影响。6.利用裸小鼠皮下移植瘤实验和尾静脉注射肺转移模型,从体内水平分析NSUN2对EGFR-TKI原发性耐药肿瘤生长及转移的影响。结果1.通过分析TCGA与GEO数据库,结果显示,肺癌组织中NSUN2表达高于正常组织,且NSUN2的高表达与肺癌的预后呈负相关。2.Western blot、Q-PCR分析临床肺癌样本显示,肺癌组织中的NSUN2的表达显著高于正常组织。3.免疫组化染色结果显示,EGFR-TKI原发性耐药患者中的NSUN2表达水平显著高于敏感患者;且在原发性耐药患者组织中,高表达NSUN2的细胞处于肿瘤组织边缘。4.免疫组化及免疫荧光染色分析均发现吉非替尼能显著降低原发性耐药患者的EGFR磷酸化水平,却不能降低患者肿瘤组织的NSUN2表达水平。5.体外细胞水平:克隆形成实验发现敲低NSUN2能显著降低原发性耐药细胞NCI-H1650细胞克隆形成能力;细胞划痕实验和transwell实验结果显示,敲低NSUN2能明显减弱原发性耐药细胞的迁移及侵袭能力;流式细胞术检测发现,敲减NSUN2表达对细胞周期无影响,但能明显诱导原发性耐药细胞发生细胞凋亡。6.体内实验结果显示,敲低NSUN2不仅能抑制原发性耐药细胞的裸小鼠皮下移植瘤的生长,还能显著抑制原发性耐药细胞的肺转移。结论1.m5C甲基转移酶NSUN2在肺癌组织中的表达显著高于正常组织,且与肺癌患者预后呈负相关;2.NSUN2在非小细胞肺癌吉非替尼原发性耐药患者中高表达,且吉非替尼不能降低患者NSUN2的表达水平。3.高表达的NSUN2在细胞和动物水平均能促进原发性耐药细胞的恶性增殖和转移。