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背景:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种以脱髓鞘为重要病理改变的自身免疫性神经系统疾病,其发病涉及复杂的过程,病理学特征主要包括炎性细胞浸润、脱髓鞘、轴索损伤等。MS患者脑中神经元在病程早期就会出现损伤,认知障碍是其常见临床症状之一,严重影响患者的工作与生活。MS发病常伴小胶质细胞过度激活,活化的小胶质细胞可以极化为M1经典激活型和M2替代激活型两种类型,其不同类型的极化对免疫炎症的不同调节作用在疾病的发病过程中扮演着重要角色,而小胶质细胞极化是否参与了MS中的认知功能障碍目前尚未明确。NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,Nox2)高表达于激活的小胶质细胞,其在调控小胶质细胞极化中发挥着重要功能。本研究以MS动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalitis,EAE)小鼠脑中的小胶质细胞异常极化为切入点,探讨Nox2在EAE早期小鼠认知障碍中的作用及机制。目的:明确EAE早期小鼠认知障碍的存在,并初步探讨Nox2调控小胶质细胞极化在EAE早期小鼠认知障碍中的作用及机制。方法:(1)构建EAE动物模型,设置Ctrl组和EAE组。利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE小鼠模型,共造模18只。Ctrl组和EAE组各8只小鼠,每日观察其行为学改变,记录其临床评分,并在特定时间点通过LFB染色观察其脊髓病理变化。Ctrl组和EAE组各10只小鼠从免疫后第6天开始进行行为学实验,包括水迷宫和条件恐惧实验,在行为学检测完成之后,第11天(病程早期)取材进行相应检测。通过Western blot方法检测突触后密度蛋白95(Postsynaptic density protein 95,PSD95)、突触蛋白-1(Synapsin-1)、脑源性神经生长因子(Brain derived neurophic factor,BDNF)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达及分布。(2)构建EAE动物模型,设置Ctrl组和EAE组。通过免疫组化检测EAE早期小鼠海马组织中小胶质细胞标记物Iba-1的表达情况。通过Western blot和q-PCR方法检测M1型小胶质细胞标志物CD16、i NOS和TNF以及M2型小胶质细胞标志物Arg-1的表达情况。(3)构建EAE动物模型,设置Ctrl组和EAE组。通过Western blot方法检测在EAE早期小鼠海马组织中Nox2蛋白的表达。(4)构建EAE动物模型,设置EAE组和EAE+Nox2抑制剂组。通过Western blot检测M1型小胶质细胞标志物CD16以及M2型小胶质细胞标志物Arg-1的蛋白表达情况。培养BV2小胶质细胞,分为Ctrl组、LPS+IFN-γ组、LPS+IFN-γ+Nox2抑制剂组。LPS和IFN-γ联合刺激BV2小胶质细胞诱导炎症反应,建立体外M1型极化模型;或提前1h给予Nox2抑制剂孵育后再给予LPS和IFN-γ联合刺激,24h后收集细胞样品。通过免疫荧光、Western blot和q-PCR检测M1型标志分子i NOS及CD16的表达。(5)构建EAE动物模型,设置Ctrl组、EAE组和EAE+Nox2抑制剂组。通过Western blot方法检测各组PSD95的表达及分布。培养BV2小胶质细胞,分为Ctrl组、LPS+IFN-γ组、LPS+IFN-γ+Nox2抑制剂组。LPS和IFN-γ联合刺激BV2小胶质细胞诱导炎症反应,建立M1型体外极化模型;或提前1h给予Nox2抑制剂孵育后再给予LPS和IFN-γ联合刺激,24h后收集细胞上清,将上清与原代培养的神经元共孵育24h后,用免疫荧光检测神经元PSD95的荧光信号强度。结果:(1)行为学结果显示:免疫后的EAE小鼠第12天开始出现运动障碍,第18天(高峰期)脊髓LFB染色显示脱髓鞘病变,说明EAE小鼠造模成功且免疫后第0-11天为EAE小鼠发病早期。免疫后的小鼠第6天开始进行水迷宫、条件恐惧等行为学实验结果显示:小鼠在病程的早期就存在记忆障碍和学习能力下降。第11天取材的样品Western blot结果显示:海马组织中PSD95、Synapsin-1和BDNF的蛋白表达下调,而Cleaved-caspase3蛋白表达上调,说明EAE早期小鼠脑内存在认知相关蛋白的表达下调和神经元损伤。以上结果表明,EAE早期小鼠存在认知障碍。(2)免疫组化结果显示:EAE早期小鼠海马中Iba-1阳性细胞数上升,说明EAE早期小鼠中的小胶质细胞明显激活。Western blot和q-PCR结果显示:小胶质细胞M1型标志分子CD16在蛋白质和m RNA水平明显上调以及i NOS、TNF在m RNA水平上调,而小胶质细胞M2型标志分子Arg-1在蛋白质和m RNA水平无明显变化。以上结果表明,EAE早期小鼠模型中的小胶质细胞向M1型极化。(3)Western blot结果显示:在EAE早期小鼠的海马组织中Nox2蛋白表达上调。以上结果表明,Nox2的高表达可能与EAE早期小鼠小胶质细胞M1极化存在相关性。(4)q-PCR和Western blot结果显示:Nox2抑制剂能够显著降低EAE早期小鼠中M1型小胶质细胞标志物CD16的表达,并能上调M2型小胶质细胞标志物Arg-1的表达。细胞水平Western blot和免疫荧光结果显示:LPS和IFN-γ联合刺激组中小胶质细胞M1型标志物CD16和i NOS较Ctrl组明显上调,说明此时BV2小胶质细胞向M1型极化。若Nox2抑制剂与BV2小胶质细胞提前孵育,则CD16的蛋白表达较刺激组明显下调,i NOS阳性细胞数较刺激组显著减少。以上结果表明,Nox2抑制后可明显降低小胶质细胞向M1型极化。(5)Western blot结果显示:抑制了Nox2后,EAE早期小鼠中PSD95的蛋白表达上升。细胞免疫荧光结果显示:LPS+IFN-γ刺激的BV2小胶质细胞上清可使神经元PSD95表达明显降低,而抑制Nox2后可使PSD95表达明显恢复。以上结果表明,抑制Nox2可通过减少小胶质细胞的M1型极化进而保护神经元突触。结论:(1)EAE早期小鼠存在认知功能障碍。(2)EAE早期小鼠小胶质细胞向M1型极化。(3)抑制Nox2可明显降低EAE早期小鼠小胶质细胞的M1型极化,上调突触相关蛋白,减少神经元突触丢失。