研究背景和目的肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC),占成人全身肿瘤发病的2-3%,大约占所有肾脏恶性肿瘤的85%,是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一。大约有70%的肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)。肿瘤转移是肾细胞癌导致患者死亡的主因,而肾细胞癌发生转移的详细机制尚不十分明确。全球范围内来看,在西方主要国家肿瘤致死病例中肾癌排名第六。按性别分析,肾癌发病率在女性恶性肿瘤中排名第九,而在男性中排名第七。在我国的泌尿系统肿瘤中,肾癌发病率仅排在膀胱肿瘤之后,排第二位。在过去的20年当中,由于诊断技术的发展,目前约有50%的患者可以得到早期诊断,但是仍有20%～35%患者在初诊时候己有转移,更有6%～15%的病患是因转移症状而来院就诊。虽然新一代分子靶向药物为代表的药物治疗手段在肾癌患者中得到了广泛的应用,很多肾癌晚期患者得到了获益,但仍约有40%的肾癌患者最终会由于肿瘤导致死亡。因肾肿瘤生物学特性特殊,对于放疗和化疗敏感性均不高,故对于晚期肾癌患者分子靶向药物已经成为了最为有效的治疗手段。恶性肿瘤是一类发病机制极其复杂的疾病,有人概括它们的基本特征包括了永生性,迁徙性,失接触抑制,生长信号自给性,凋亡逃逸以及血管生长能力。增殖与凋亡失衡是恶性肿瘤的一大特征,而细胞迁移和侵袭是恶性肿瘤发生局部侵犯和远处转移的关键步骤。故目前对于肿瘤生物学特性的研究也是从这几个重要方面来展开。肾细胞癌的发生进展过程中伴随着多种基因的表达改变。在其发生、进展进程中抑癌基因的丢失或者功能受抑制起极其关键作用。CMTM是2001年我国学者韩文玲教授在国际上首先克隆并报道的一个新基因家族,成员包括CKLF和CMTM1-8等9个,其中多个基因的编码产物目前被认为是可能起到了抑制肿瘤生长的作用。CMTM5是CMTM家族成员之一,与家族其他成员的成簇分布特征不同,它单独定位与染色体的14q11.2,目前发现有6种不同的剪切变异体,其中CMTM5-v1是这些变异体中最主要的表达形式。CMTM5人体组织中广泛表达,其表达蛋白产物在结构上介于典型的四次跨膜蛋白(Transmembrane 4 Super Family, TM4SF)和典型的趋化因子之间,但更为接近四次跨膜蛋白。现有的研究表明：一种四次跨膜蛋白可以和多种其它蛋白发生互相的作用,对细胞的分化,粘附,溶解,信号传导等生物学特性均具有重要意义。它们可以通过召集其它信号分子形成蛋白网络。参与这个网络组成的蛋白包括：整合素,T细胞受体,酪氨酸激酶受体等。其中表皮生长因子受体(EGFR)是一种在人体各个器官组织中均存在广泛分布的细胞膜酪氨酸激酶受体。表皮生长因子受体被被配体激活后,经由胞浆中的衔接蛋白、酶的级联放大反应,激活基因的转录,调节细胞黏附和迁移,与肿瘤的发生和进展密切存在密切关系。目前,以EGFR为作用靶点的药物已进入临床应用阶段,在晚期肾脏肿瘤的治疗中发挥着举足轻重作用。TM4SF分子对EGFR具有调控作用,提示该家族分子可能在肿瘤生物治疗中具有潜在应用前景。现有多项研究证实CMTM1、3、5、7、8等家族中多个成员具有可能起抑癌基因的作用。目前已经在多种恶性肿瘤的研究中,发现了CMTM3表达显著减低,而上调CMTM3表达后,可以通过ERK1/2信号通路抑制金属蛋白酶MMP2使肿瘤细胞的侵袭性下降,通过抑制AKT通路的激活,减缓细胞的增殖。CMTM4可以通过阻滞细胞周期在G2/M限制点以抑制宫颈癌细胞和肾癌细胞的生长。CMTM7也是通过使膜上的EGFR的内化,从而导致了下游PI3K/AKT通路受抑制,最终使肿瘤细胞生长减缓。而CMTM8除了通过EGFR的细胞内化,导致EGF-EGFR复合物的减少,进而抑制EGFR下游信号通路的激活,促进抑癌基因Bad的磷酸化,抑制细胞生长；还会可以通过c-MET信号传导通路,减低癌细胞的侵袭性。同时CMTM8还可使癌细胞对化疗药增加敏感,和化疗药物起到互相协同抗癌作用。目前的研究表明在前列腺肿瘤,胰腺肿瘤,宫颈癌,胃癌等多种肿瘤组织中,CMTM5表达远远低于相对应的正常组织。而通过技术手段在肿瘤细胞中恢复CMTM5表达后,肿瘤的生长可以受到抑制,说明其可能是一个抑癌基因。也有更深入的研究表明CMTM5可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路来减慢癌细胞生长速度,而且CMTM5可以增强肿瘤坏死因子的抗肿瘤细胞生长作用。PI3K/AKT信号传导通路是生物体内最主要的信号传导通路之一。在肾细胞癌中,目前已经证实癌细胞可以通过自分泌VEGF, VEGF与受体VEGFR结合,激活上述信号通路抑制细胞凋亡,促进细胞生长。如何抑制上述通路的在肿瘤中的激活故而成为了目前生物学研究的一大热点。我们推测CMTM5是否在肾癌中也可以通过上述通路抑制肿瘤生长。本研究的目的是研究CMTM5在肾癌组织和正常肾组织中的表达差异,并在肾肿瘤细胞系中进一步进行结果验证,探索其与临床病理学的关系。恢复CMTM5在肾癌细胞中表达,并通过荧光定量PCR分析和蛋白质印迹分析的手段进行验证,观察分析其对肾肿瘤细胞ACHN的增殖、细胞周期、凋亡以及细胞迁移侵袭等生物学行为的影响,并初步探索探讨CMTM5在这一过程中的作用机制。实验方法1.利用组织芯片和免疫组化技术检测75例肾透明细胞癌患者肿瘤组织以及相匹配的正常组织病理切片中CMTM5的蛋白表达情况,分析其表达水平及与肿瘤恶性度之间的关系。另外选取肾癌细胞系ACHN、CAKI1和OS-CA-2细胞,以HK2细胞作为对照,对各细胞株的CMTM5基因表达进行定量PCR检测。2.将含CMTM5基因慢病毒载体,通过慢病毒转染入肾肿瘤ACHN细胞株,使ACHN细胞表达CMTM5,通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹法分析转染CMTM5慢病毒载体的实验组、转染慢病毒空载体的阴性对照组及未转染的空白对照组等3组中CMTM5的表达情况。3.设立转染CMTM5载体的实验组、转染空载体的阴性对照组及空白对照组三组,以Cell Counting Kit-8方法测定肿瘤细胞生长增殖能力、以流式细胞技术对肾肿瘤细胞周期和凋亡进行检测及以Transwell技术对实验对象的细胞迁移、侵袭能力检测,明确CMTM5对肾肿瘤细胞ACHN的各种生物学特征的影响。4.通过上述的检测结果结合文献推测CMTM5作用的可能信号通路PI3K/AKT进行蛋白免疫印迹检测。检测CMTM5过表达后ACHN细胞PI3K/AKT通路以及下游中增殖相关的P21、cyclinD、cyclinE,凋亡相关的Bc12、Bax、Bad、cleaved caspase3以及侵袭相关的MMP家族蛋白的表达变化。5.统计学处理采用SPSS20.0软件包进行数据的统计分析处理,所有计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示。卡方检验方法分析免疫组化CMTM5表达与临床因素之间的关系。细胞系实验结果多组数据之间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),如方差分析具有显著性差异,则进一步最小显著差数法(LSD法)比较两两之间的差异,若组间方差不齐,可采用Dunnett T3法分析两两之间的差异；指标间相关性以Pearson相关系数来表示,P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果1.通过组织芯片技术以75个肾细胞癌组织作为实验组,以每个癌组织配对的癌旁正常肾组织作为对照组。SP两步法进行免疫组化检测得出CMTM5主要表达位置在细胞膜,且在正常组中(73/75,97%)的表达明显高于肿瘤组(27/75,36%),差异具有统计学意义(P<0.001)。但临床病理学分析显示CMTM5的表达程度与肾癌患者年龄,性别,肿瘤的分期以及分级等因素的关系不具有统计学意义(均P>0.05)。荧光定量PCR检测同样证实了在ACHN, CAKI1以及OS-CA-2等肾肿瘤细胞系中,CMTM5 mRNA表达也均要显著低于作为对照的HK2细胞(均P<0.001)。2.成功建立表达CMTM5基因的ACHN细胞株,经荧光定量PCR检测和细胞蛋白质印迹检测检测,转染空载体的阴性对照组及未转染慢病毒的空白组的CMTM5 mRNA表达很低,CMTM5蛋白几乎没有表达,实验组的CMTM5表达较对照组在mRNA水平以及蛋白水平的表达均有显著提高。3. Cell Counting Kit-8法细胞增殖率研究结果表明：在48小时时间点上不同细胞系之间增殖状况有显著差异(F=1 12.29,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,结果表明和空白对照组相以及阴性对照组相比,CMTM5实验组中生长受明显抑制,差异具有显著性(均P<0.001)。在72小时时间点上不同细胞系之间有显著差异(F=38.65,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,结果表明和空白对照组相以及阴性对照组相比,CMTM5实验组中生长受明显抑制,差异具有显著性(均P<0.001)。转染CMTM5组ACHN细胞在转染48小时和72小时细胞增殖明显受抑制；结果表明在ACHN细胞中恢复CMTM5基因表达可显著抑制其细胞增殖。4.流式细胞术检测结果显示：与不携带CMTM5基因的阴性对照组以及空白对照组相比较,CMTM5组细胞周期中G1期细胞比例显著增加；在24小时时间点上G1期细胞比例在不同细胞系之间有显著差异(F=451.95,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,结果表明和空白对照组相比,但在CMTM5实验组中明显增高(P<0.001)；此外,和阴性对照组相比,G1期细胞比例在CMTM5实验组中也是增高的,差异具有显著性(P<0.001)。在48小时时间点上,G1期细胞比例在不同细胞系之间有显著差异(F=943.05,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,结果表明和两对照组相比,G1期细胞比例在CMTM5实验组中明显增高(均P<0.001)。同时与未转染组以及阴性对照组比较,转染CMTM5组ACHN细胞48小时后增殖指数下降(42.37±1.04%；42.98±0.43%；21.77±0.33%,F=951.41,P<0.001)。结果提示恢复CMTM5表达后,ACHN细胞的细胞周期被阻滞于G1期；细胞周期在G1/S限制点受到阻滞,细胞增殖受到抑制。进一步行流式细胞术细胞凋亡测定结果显示：在转染后72小时,与未转染组(5.42±0.54%相比,转染空载质粒的阴性对照组(5.41±0.20%)凋亡率不明显,而转染CMTM5的实验组细胞凋亡率显著上升(12.53±0.20%),差异具有统计学意义(F=405.80,P<0.001)。结果表明恢复CMTM5基因表达可以通过使细胞周期阻滞在G1期来减缓细胞生长,同时还可以加速肿瘤细胞的凋亡。5.微孔滤膜培养小室培养系统(Transwell)实验检验ACHN细胞迁移与侵袭能力：转染CMTM5实验组,空载慢病毒对照组和未转染空白对照组等三组中的ACHN细胞在迁移和侵袭试验里均有部分细胞到达下室。在迁移试验中,未转染空白对照组、转染空载慢病毒组和转染CMTM5实验组的吸光度值分别为0.155±0.002、0.148±0.005、0.073±0.005。使用方差分析比较迁移能力在空白对照组、空载体组及CMTM5实验组中差异,结果显示迁移能力在不同细胞系之间有显著差异(F=332.86,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,和阴性对照组相比,在CMTM实验组中细胞迁移减弱,差异具有显著性(P<0.001)。在侵袭试验中,未转染空白对照组、转染空载慢病毒组和转染CMTM5实验组的吸光度值分别为0.137±0.001、0.129±0.007、0.063±0.004。使用方差分析比较侵袭能力在空白对照组、空载体组及CMTM5实验组中差异,结果显示侵袭能力在不同细胞系之间有显著差异(F=235.36,P<0.001),进一步使用LSD法进行两两比较,和阴性对照组相比,在CMTM5实验组中细胞侵袭减弱,差异具有显著性(P<0.001)。6.根据细胞生物学研究结果,选择蛋白质印迹检测对PI3K/AKT信号通路中的相关关键蛋白进行检测,结果显示过表达CMTM5后磷酸化AKT(pAKT)及与细胞活性密切相关的细胞周期蛋白P21,CyclinD,E均表达降低。提示CMTM5很可能通过减低AKT磷酸化水平,影响下游分子活性,从因一步抑制了肾癌肿瘤细胞的生长；下调Bc12,上调Bax、Bad、cleaved caspase3促进ACHN细胞凋亡；下调金属蛋白酶家族成员MMP2,MMP9表达减慢ACHN细胞迁移和侵袭。统计学分析显示与空白对照以及阴性对照组比较,过表达CMTM5后上述的蛋白表达差异均具有统计学意义(组间比较,均P<0.05)。结果显示CMTM5在ACHN细胞中通过降低磷酸化AKT (pAKT)及下游分子发挥抑癌作用。结论1.CMTM5在肾细胞癌中低呈现表达,可能抑制肿瘤的发生、发展,是一个潜在的抑癌基因。2.恢复CMTM5基因表达可以抑制肾肿瘤细胞ACHN的生长殖增、迁移,促进凋亡等的生物学行为,其机制可能与PI3K-AKT信号通路受抑制相关。因此CMTM5基因有希望成为肾癌靶向治疗的新基因靶点。