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目的:1.探究miR-22在小鼠胚胎干细胞干性维持中的作用。2.探究Wdr82在小鼠胚胎干细胞干性维持及谱系分化中的功能。方法:一.为研究miR-22在小鼠胚胎干细胞中的功能,我们拟利用CRISPR/Cas9技术获得miR-22敲除的小鼠胚胎干细胞。首先,利用点突变和搭桥PCR等方法构建neomycin(neor)抗性的sg RNA表达载体(PGL3-2sg RNA-neor),并设计靶向miR-22的sg RNA,克隆至该载体中;其次,将靶向敲除miR-22的sg RNA载体电转至稳转Cas9的细胞系中,并通过药物筛选、基因型鉴定等方法筛选miR-22敲除的胚胎干细胞;最后,对miR-22敲除克隆进行功能分析。二.为探索Wdr82在小鼠胚胎干细胞干性维持及谱系分化中的功能,我们拟通过条件性敲除及过表达的方法进行研究。首先,将CRISPR/Cas9和Cre-Lox P系统相结合,构建Wdr82条件性敲除的细胞系;其次,加4-OHT诱导Wdr82纯合敲除,利用RT-q PCR检测干性标志基因的表达,利用拟胚体实验及RT-q PCR研究检测内、中、外胚层和滋养外胚层分化基因的表达;最后,构建Wdr82过表达细胞系,进行挽救实验。结果:1.miR-22缺失并未影响胚胎干细胞的细胞形态以及Oct4、Sox2和Nanog等干性基因的表达。2.Wdr82缺失并未引起干性相关因子(Oct4、Sox2、Nanog和Klf4等基因)表达及细胞形态发生明显的变化。3.在胚胎分化的不同时期:与对照组相比,Wdr82缺失克隆内胚层标志蛋白(Gata6、Sox17)提前高表达,中、外胚层标记蛋白(T、Mixl1、Fgf5)表达显著降低,而神经外胚层标记蛋白表达没有发生显著变化。同时在Wdr82缺失的细胞系中过表达Wdr82能够挽救wdr82缺失造成的中内外胚层分化紊乱。结论:1.本实验利用CRISPR/Cas9技术构建miR-22敲除的小鼠胚胎干细胞,发现miR-22对小鼠胚胎干细胞的干性维持并非必需,而其对胚胎干细胞谱系分化和命运决定的影响还有待进一步研究。2.本实验利用新颖的CRISPR/Cas9与条件性敲除相结合的敲除技术构建Wdr82敲除的胚胎干细胞,发现Wdr82缺失并未影响胚胎干细胞的细胞形态和干性相关基因的表达。但是,在拟胚体分化不同时期,Wdr82缺失导致胚胎干细胞向内胚层提早分化,显著抑制中、外胚层分化,而对于神经干细胞谱系分化并无显著差异。同时,Wdr82过表达能够挽救Wdr82缺失导致的胚胎干细胞分化紊乱。上述结果表明:Wdr82对于维持小鼠胚胎干细胞不同胚层分化趋势的变化有着重要的调控作用。然而,Wdr82调控小鼠胚胎干细胞分化的分子机理还有待深入研究。