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乳腺癌是导致妇女癌症死亡的第二大原因。乳腺癌中发生乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene,BRCA1)和BRCA2基因突变的携带者高达45-80%,且存活率非常低。目前临床上尚无根治BRCA基因突变型乳腺癌的有效疗法,所以有效治疗药物的研发极为迫切。BRCA1和BRCA2基因在细胞生长过程中对维持基因组的稳定性起着重要作用,其突变与乳腺癌发病高度相关。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)是存在于真核细胞的参与DNA修复的核酶,主要与碱基切除修复(base excision repair,BER)中的DNA单链损伤修复密切相关。当它被抑制时,因BER缺陷会导致细胞内产生大量不能及时修复的DNA单链损伤,从而产生大量DNA双链损伤(double strand breaks,DSB)。这些DNA双链损伤在正常细胞内可以通过BRCA1/2等因子共同参与介导的高保真同源重组(homologous recombination,HR)途径得到修复;而在BRCA基因缺陷的肿瘤细胞内,由于缺少HR修复途径,造成DSB不能修复或者由容易出错的非同源重组末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复,从而大大增加了BRCA缺陷的肿瘤细胞的死亡概率,称为协同致死作用。PARP抑制剂正是通过上述的协同致死作用对BRCA基因缺陷的卵巢癌和乳腺癌发挥药理作用的。本研究对前期筛选获得的在酶水平具有较强PARP抑制活性的26个新结构化合物(AZD2281的类似物)进一步进行体内和体外抗肿瘤活性的筛选与评价,并对其抗肿瘤作用的特点和机制进行探索,旨在获得对BRCA突变乳腺癌具有较好治疗前景的PARP抑制剂提供实验依据。一、PARP抑制剂的体外抗肿瘤活性筛选与评价本部分通过观察PARP抑制剂单用对BRCA突变肿瘤细胞的药效以及与DNA烷化剂替莫唑胺合用对BRCA非突变肿瘤细胞的药效,从26个新结构化合物中筛选活性较好的化合物进行后续的筛选与评价。1.PARP抑制剂单用对BRCA突变肿瘤细胞的影响本部分通过检测细胞活力及凋亡考察PARP抑制剂单用对BRCA突变肿瘤细胞的影响,筛选活性较好的化合物。1.1 PARP抑制剂单用对BRCA突变肿瘤细胞增殖的影响选用人源BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞,采用CCK-8法检测26个受试化合物与已上市的PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib/AZD2281,Lynparza)单独使用时的细胞存活的影响。结果表明,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)、XML12022901(化合物13)和XML12032104(化合物19)等15个化合物可显著抑制MDA-MB-436细胞的增殖,IC50在15-70μM之间,与阳性药AZD2281的作用强度接近。1.2.PARP抑制剂单用对BRCA突变肿瘤细胞凋亡的影响采用BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞,通过流式细胞术观察了上述15个具有较强体外抑瘤作用的PARP抑制剂对细胞凋亡的影响。结果发现,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等9个化合物能不同程度地增高细胞晚期凋亡率,且具有明显浓度依赖性,提示它们具有诱导晚期细胞凋亡作用。2.PARP抑制剂与替莫唑胺合用对非BRCA突变肿瘤细胞增殖的影响采用CCK-8法观察了受试化合物与烷化剂类抗肿瘤药物替莫唑胺合用时对人源的肺腺癌细胞系A549细胞活力的影响。研究发现,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等7个化合物与替莫唑胺合用具有一定的增效作用。综合考虑化合物单用与合用的结果以及结构多样性和成药的难易程度等因素,本研究进而选择体外抗肿瘤活性较好的化合物5和化合物19,在整体动物水平初步评价了它们的抗肿瘤活性。二、PARP抑制剂体内抗肿瘤活性评价本部分选择PARP抑制剂XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19),在人源BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436移植瘤模型上,评价它们的体内抗肿瘤活性。首先建立BALB/C裸小鼠乳腺癌异种移植瘤模型,进而观察灌胃给予PARP抑制剂23天对肿瘤生长的影响。结果发现,给药23天后阳性对照药AZD2281(50mg/kg)和受试化合物5(50mg/kg)及化合物19(50mg/kg)都能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,抑瘤率分别为80.6%、73.6%、88.8%。各给药组肿瘤体积均明显小于溶剂对照组,且体重无明显下降,肿瘤也无转移。结果提示,化合物5和化合物19在整体动物水平对BRCA突变的乳腺癌具有明显抑制作用。三、PARP抑制剂的作用机理研究本部分主要通过考察PARP抑制剂对BRCA突变及非突变肿瘤细胞的作用差异,研究PARP抑制剂通过协同致死作用发挥抗肿瘤药效的作用机制。1.PARP抑制剂对BRCA突变及非突变肿瘤细胞增殖的影响采用CCK-8法观察筛选获得的4个高活性化合物5、7、13、19对人源的BRCA突变乳腺癌细胞系MDA-MB-436及BRCA非突变人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖的作用。结果发现,四个化合物对MDA-MB-436细胞具有选择性抑制作用,而对MDA-MB-231、MCF-7细胞的增殖抑制作用较弱。提示4个化合物对BRCA突变细胞的抑制作用均强于其对于非BRCA突变细胞的抑制作用,提示它们在抗BRCA突变乳腺癌中具有进一步研究的价值。2.PARP抑制剂对BRCA突变及非突变肿瘤细胞凋亡的影响进一步采用流式细胞术检测4个化合物对人BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436和BRCA非突变人乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的影响。研究结果表明,化合物5、7、19能够明显诱导MDA-MB-436细胞晚期凋亡,且呈浓度依赖性,100μM细胞凋亡率高达80%左右。而PARP抑制剂1~100μM在MCF-7细胞凋亡率都不到25%。化合物13对两种细胞凋亡都没有明显影响。提示上述3个化合物能够通过选择性诱导BRCA突变细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,这可能是它们选择性抑制BRCA突变细胞增殖的重要机制之一。3.PARP抑制剂对BRCA突变及非突变肿瘤细胞周期的影响采用流式细胞术检测化合物5、7、13、19对人源的BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞和BRCA非突变人乳腺癌细胞系MCF-7细胞周期的影响。结果显示,化合物5、7、19能浓度依赖性诱导MDA-MB-436和MCF-7细胞周期阻滞在G2期和S期。化合物13对两种细胞周期都没有明显影响。提示化合物5、7、19可能通过将肿瘤细胞阻滞在G2期和S期发挥抗肿瘤作用,但对BRCA突变及非突变肿瘤细胞无选择性。4.PARP抑制剂对BRCA突变细胞中PAR蛋白表达的影响ADP核糖聚合物(poly(ADP-ribose),PAR)蛋白含量是反映DNA损伤修复程度的重要指标。采用Western blotting检测化合物5、7、13、19对人源的BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞中PAR蛋白的表达。结果发现,随着PARP抑制剂(化合物5、7、19)浓度的升高,PAR的表达量呈逐渐降低趋势。化合物13对PAR蛋白的表达无明显影响。提示化合物5、7、19可能通过抑制PAR蛋白的表达,致使肿瘤细胞的DNA损伤修复减少,从而导致细胞死亡。综上所述,本论文可以得出以下结论:1.在26个分子水平抑酶活性较好的PARP抑制剂中,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)和XML12032104(化合物19)可选择性抑制BRCA突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,并呈浓度依赖性。2.PARP抑制剂XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)能够显著抑制BRCA突变的乳腺癌异种移植瘤小鼠肿瘤的生长,其作用强度与AZD2281接近。3.PARP抑制剂单用对BRCA突变的肿瘤细胞具有选择性抑制作用,其作用机制可能包括:(1)可选择性诱导BRCA突变肿瘤细胞的晚期凋亡;(2)可非选择性地将肿瘤细胞阻滞在G2和S期;(3)可能通过抑制PAR蛋白的表达使肿瘤细胞的DNA损伤修复减少,从而促进细胞死亡。综上所述,本研究筛选获得了XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)等对BRCA突变的肿瘤细胞具有选择性抑制作用的新PARP抑制剂,并发现化合物5和19在整体动物水平对裸鼠BRCA突变的移植瘤具有显著抑制作用。本研究发现化合物5等PARP抑制剂抗肿瘤作用的机制可能是与诱导细胞凋亡、诱导细胞周期的阻滞、抑制PAR蛋白的表达进而阻断DNA损伤修复相关。