目的:体外获取和分离人脱落乳牙牙髓干细胞并采用胰酶消化、有限稀释法对其纯化,培养并分析干细胞干性;采用VEGF-A与SB-431542联合诱导人脱落乳牙牙髓干细胞,初步探讨其分化为内皮细胞的高效性,为研究牙源性干细胞高效分化内皮细胞提供一种新思路。方法:1、人脱落乳牙牙髓干细胞的获取、分离、纯化、培养及细胞干性鉴定选取山东大学口腔医学院儿牙科因滞留而拔除的健康乳前牙,在无菌状态下获取滞留乳牙牙髓组织,并采用胰酶消化法获取单细胞的悬液,有限稀释法进行分离、纯化。倒置显微镜下观察人脱落乳牙牙髓干细胞原代、传代细胞形态和生长状况。流式细胞仪检测分析CD45、CD73、CD90、CD105表面抗原阳性表达情况。选取第三代处于生长对数期的人脱落乳牙牙髓干细胞,体外成脂诱导液诱导,向脂肪组织分化。观察细胞形态变化及胞内成脂情况,4周后油红-0染色。选取第三代人脱落乳牙牙髓干细胞,体外成骨诱导液诱导培养,第1周和第3周分别行碱性磷酸酶和茜素红染色,检测是否有矿化结节的形成,进一步鉴定人脱落乳牙牙髓干细胞多向分化能力。2、体外VEGF-A与SB-431542联合诱导人脱落乳牙牙髓干细胞向内皮细胞分化:将处在生长对数期的第三代人脱落乳牙牙髓干细胞以3×103个/cm2分别接种于α-MEM、VEGF-A、VEGF-A+SB-431542联合培养基中,隔天更换一次培养液,分别提取第7天、第14天的上述细胞,RT-PCR、Western blot分别检测三组实验内皮细胞相关基因、蛋白表达情况。统计分析:所有实验组一式三份进行,所有数值以平均值±标准偏差(SD)来表示。使用单因素方差分析确定是否具有统计学显著性差异,并将具有统计学意义的阈值设定为P<0.05。结果:1、酶消化法和有限稀释法获得了纯的人脱落乳牙牙髓干细胞,显微镜下人脱落乳牙牙髓干细胞排列紧密,呈集落状生长。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD45阳性检出率为2.8%,CD73阳性检出率为99.8%,CD90阳性检出率为99.5%,CD105阳性检出率为94.2%。人脱落乳牙牙髓干细胞经成脂诱导液诱导4周后,油红-0染色阳性细胞内呈现橙红色颗粒。成骨诱导液诱导,有钙化结节逐渐形成,茜素红染色呈现橘红色或深红色;ALP染色细胞胞浆呈现均匀的蓝色。2、实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)结果显示:诱导7天、14天无论是单纯的VEGF-A组还是VEGF-A+SB-431542组,均有特异性内皮细胞分子(VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2 和 Tie-2)的表达。诱导 7 天后,与单纯 VEGF-A组相比,用VEGF-A和SB-431542联合培养的人脱落乳牙牙髓干细胞显示出更高的VEGFR-2表达(P<0.05),VEGFR-1、CD31也呈现出相似的高表达状态。与单独的VEGF-A组相比,人脱落乳牙牙髓干细胞在含有VEGF-A和SB-431542培养基中连续培养14天后内皮细胞相关基因(VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2和Tie-2)表达显着增加(P<0.05)。Western blot检测相应蛋白的表达情况:培养7天和14天,VEGF-A组及VEGF-A+SB-431542组均能产生内皮细胞的特异性蛋白(CD31和VEGFR-2)。但无论是第7天还是第14天,联合组诱导分化的内皮细胞特异性蛋白表达量均高于VEGF-A单纯组。结论:1、体外获取、分离并采用酶消化法和有限稀释法可以获得纯的人脱落乳牙牙髓干细胞。流式细胞术检测人脱落乳牙牙髓干细胞表达早期的间充质干细胞标志物,人脱落乳牙牙髓干细胞可以向成骨和成脂诱导分化,具有多向分化潜能,因而具有干细胞干性。2、VEGF-A单纯诱导人脱落乳牙牙髓干细胞可以向内皮细胞分化,但VEGF-A与SB-4315412联合诱导则可以显著增强这一过程。