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选用珍稀药用植物杜仲,采用常规的真菌分离方法,从中分离出了44株内生真菌,并以此为对象进行了以下研究工作。
根据黄酮类和环烯醚萜类化合物所具有的颜色反应,初步筛选出可能生产黄酮类化合物的菌株3株--DZ2、DZY5、DZ11。进一步通过紫外-可见光光谱扫描,并检测其产物稳定性,最终确定菌株DZ11可能产黄酮类化合物--槲皮素,并且产量相对稳定,故作为下一步的实验菌株。
绘制DZ11菌株的生长曲线和槲皮素产量的变化曲线,通过紫外分光光度法和rLC法测定槲皮素的最高产量,分别为0.4118mg/L和0.340mg/L。利用HPLC法分析发现DZ11菌株所产槲皮素在发酵液和菌丝体内都存在,但菌丝体内含量相对较少。通过常规湿法装柱,对DZ11菌株发酵液进行柱层析分离,得到6种不同Rf值的成分,其中第5部分有着与槲皮素标准品相同的紫外.可见光光谱。经再次纯化,通过质谱检测其[M+H]+的m/z为303.38,与槲皮素的分子量302.23正好相符。再对照样品和槲皮素标准品的红外吸收图谱,发现它们的红外光谱图几乎相同,也就是说明它们含有相同的结构基团或化学键。由此确定DZ11菌株所产的活性物质中含有槲皮素。
通过对不同固体培养基中菌落的生长速率和长势分析,发现在豆芽汁培养基上不但菌丝生长较快而且菌丝较为浓密。通过对不同液体培养基中DZ11的生物量和槲皮素产生量的对比,筛选出适合DZ11菌丝生长及产物槲皮素合成的豆芽汁液体培养基。在基本液体培养基的基础上,通过单因素分析实验,确定实验室发酵DZ11菌株的最佳碳源、氮源、PH值和温度分别是蔗糖、脲、7.0和28℃。通过正交试验,得出适合菌丝生长的培养基为:把豆芽汁液体培养基中的蔗糖量改为25g/L,添加脲2g/L,装量为120ml/300ml;适合槲皮素积累的培养基的为:把豆芽汁液体培养基的蔗糖量改为30g/L,添加脲2.5g/L,装量为100ml/300ml。
根据DZ11菌株的显微结构特征,对DZ11菌株进行了分类,初步确定为真菌门,半知菌类,腔孢纲,球壳孢目,球壳孢科中的刺茎点菌属。