【背景】随着诊断和治疗技术的进步,早期胃癌患者5年的生存率已明显提高,但伴有淋巴结转移和远处转移的进展期胃癌患者的预后仍然没有改善。由于其确切的机制仍不清楚,目前仍然缺乏早期诊断和有效治疗的方法。因此,胃癌转移已成为影响胃癌患者疗效和获得长期生存的关键问题。继续深入开展胃癌转移的基础研究,阐明胃癌转移的分子机制,仍然是解决胃癌转移的预测、早诊,提高胃癌患者疗效、改善胃癌患者预后的突破口。近年来研究发现的一种内源性、单链、非编码的小RNA分子,即microRNA(miRNA),通过负性调控靶基因的表达,在肿瘤转移中起着非常重要的作用。由于miRNA“一对多”的作用方式,即它可同时调控多个蛋白质编码基因以及多条与肿瘤生长、凋亡、转移相关的分子通路,所以靶向miRNA的干预比蛋白质编码基因能更有效地控制、逆转涉及多基因改变的肿瘤转移表型。然而,miRNA是否参与了胃癌转移的发生?有哪些miRNA参与了胃癌转移?它们起着什么样的作用?通过什么样的途径起作用?靶向miRNA的干预是否能有效逆转胃癌细胞的转移表型?这些问题都不清楚,miRNA在胃癌转移中的作用及作用机制还需进一步的研究和探索。【目的】筛选、鉴定胃癌转移相关的miRNA,研究miRNA分子在胃癌转移过程中的作用及其作用机制,进一步从新的角度理解胃癌转移的发生,为胃癌转移的预防、早期诊断、分子分型以及选择合适的靶点进行干预和治疗提供新的理论依据。【方法】1.利用体外反复的Tanswell侵袭实验分别筛选、建立高转移潜能(MKN28-M,SGC7901-M)和低转移潜能(MKN28-NM,SGC7901-NM)的胃癌细胞亚系,然后对各细胞亚系的生物学特性进行鉴定。用MTT、裸鼠成瘤检测各细胞亚系的生长、增殖能力;用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;用Tanswell迁移和侵袭实验、划痕实验、裸鼠尾静脉注射内脏转移实验检测细胞的侵袭和转移能力。2.采用高通量的miRNA芯片检测高转移潜能( MKN28-M ,SGC7901-M)和低转移潜能(MKN28-NM,SGC7901-NM)胃癌细胞亚系的miRNA表达谱,筛选不同转移潜能胃癌细胞间差异表达的miRNA的分子,用qRT-PCR分别在细胞、组织标本中对芯片的结果进行验证。3.结合芯片结果及文献报导,对miR-218进行深入的功能研究。收集40例胃癌、癌旁及部分转移灶的冰冻和石蜡包埋组织标本,用qRT-PCR检测胃癌及癌旁组织中miR-218的表达水平,分析miR-218的表达水平与胃癌临床病理参数的关系。4.构建miR-218的表达载体,分别将miR-218的表达载体及寡核苷酸抑制剂转染胃癌细胞,上调和下调miR-218的表达,用MTT、裸鼠成瘤、Tanswell迁移和侵袭实验、裸鼠尾脉注射内脏转移实验分别在体外和体内观察miR-218对胃癌细胞生长、增殖和转移的影响。5.用生物信息学软件(PicTar、MiRand、TargetScan)预测miR-218的靶基因,对预测的靶基因用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/ )进行功能的聚类分析,筛选出与细胞迁移、侵袭能力相关的基因,再分析其与miR-218的匹配程度,挑出与细胞的迁移、侵袭能力关系最密切,与miR-218结合最紧密的靶基因进行研究。通过生物信息学预测,Robo1可能是miR-218的靶基因之一。6.我们用qRT–PCR检测GES, MKN28-NM,SGC7901-NM,MKN28-M和SGC7901-M细胞中miR-218和Robo1 mRNA的表达水平并分析其表达相关性。用miR-218的表达载体和抑制剂分别上调和下调miR-218在胃癌细胞中表达,用Western blot检测miR-218表达变化后对Robo1的影响。用免疫组化检测Robo1在癌旁、胃癌、胃癌转移灶中的表达水平,并分析miR-218与Robo1在表达上的相关性。7.生物信息学分析miR-218在Robo1 mRNA 3′-UTR上的结合位点,构建含miR-218结合位点的Robo1的3′-UTR的荧光报告基因表达载体,与miR-218共转染,观察miR-218对荧光报告基因的表达调控作用。分别构建miR-218结合位点突变的Robo1的表达载体及靶向Robo1的siRNA载体,用突变的Robo1表达载体和miR-218的表达载体共转染MKN28-M细胞,使Robo1和miR-218同时过表达,观察Robo1对miR-218抑制胃癌细胞转移的拮抗作用;用Robo1的siRNA载体转染MKN28-M细胞,观察是否会出现转染miR-218相似的表型变化。8.用qRT-PCR检测胃癌组织中miR-218、miR-218-1、miR-218-2、Slit2、Slit3的表达水平,并分别分析miR-218、miR-218-1、Slit2,miR-218、miR-218-2、Slit3之间的表达相关性,揭示miR-218表达下调的原因以及miR-218同时与Slit/Robo1这一对配体、受体分子相互作用的独特的受体信号调控模式。【结果】1.体外及体内的实验结果表明, MKN28-M , SGC7901-M与MKN28-NM,SGC7901-NM相比,其侵袭、转移能力明显增强,而生长、增殖能力和细胞周期没有明显差别。2. miRNA芯片共筛选出45个在高转移潜能( MKN28-M ,SGC7901-M)和低转移潜能(MKN28-NM,SGC7901-NM)胃癌细胞亚系间差异表达的分子(>1.5倍),表达上调的11个,表达下调的34个。其中miR-218表达下调较为显著,且既往文献报导其在胃癌组织中表达下降,提示miR-218可能是一个既参与胃癌发生,又影响胃癌转移的关键分子。在细胞及组织中验证的结果表明,miR-218在高转移潜能的胃癌细胞及大部分(7/10)胃癌转移组织中表达明显下调,与芯片结果一致。3. miR-218的表达水平与胃癌临床病理参数的分析结果表明,其表达降低的程度与胃癌的临床分期、淋巴结转移以及胃癌患者的预后密切相关。4.体外及体内的功能研究表明miR-218可以抑制胃癌的侵袭和转移,对胃癌细胞的生长增殖能力没有明显的影响。5.生物信息学预测提示,Robo1可能是miR-218的靶基因之一。在细胞和临床组织标本中,Robo1在胃癌尤其是高转移潜能的胃癌中,表达增强,与miR-218的表达负相关。6.用miR-218的表达载体上调miR-218的表达时,Robo1表达下调;而用miR-218的抑制剂抑制其功能时,Robo1表达上调。萤光报告基因实验也证实,miR-218可以抑制含有其结合位点的萤光报告基因的活性,而对突变体及对照质粒没有影响。用miR-218结合位点突变的Robo1的表达载体使miR-218与Robo1同时过表达时,Robo1可以对抗miR-218对胃癌细胞迁移、侵袭的抑制作用,而用siRNA下调Robo1的表达,可达到与miR-218过表达相似的效果。从而证实了miR-218通过负性调控Robo1参与胃癌转移。7. Slit的受体Robo1是miR-218的靶基因,受miR-218的负调控。同时,miR-218的两个编码基因miR-218-1、miR-218-2分别位于Slit2、Slit3基因的内含子中。qRT-PCR检测的结果表明,在胃癌组织中,miR-218-1,miR-218-2与Slit2, Slit3的表达明显正相关,提示在胃癌中,miR-218-1、miR-218-2分别与其宿主基因Slit2、Slit3共表达;而miR-218的表达与miR-218-2表达明显正相关,与miR-218-1的表达没有明显的相关性,表明在胃癌中miR-218的表达降低主要是由于miR-218-2的表达下调引起,而与miR-218-1无关;与此一致的是,在胃癌中,Slit3的表达明显下调,而Slit2的表达没有明显变化,从而在Slit,miR-218和Robo1之间形成一个负性调控的反馈环,miR-218以一个负性调控分子的角色维持着这一信号通路的动态平衡,这一信号通路活性的改变参与胃癌的侵袭和转移。【结论】1.成功建立了胃癌转移的细胞模型,为胃癌转移的相关研究提供了良好的平台。2.在高转移潜能的胃癌细胞和低转移潜能的胃癌细胞间有众多差异表达的miRNA分子,提示miRNA在胃癌转移中起着重要的作用。3. miR-218在胃癌中表达降低,尤其是高转移潜能的胃癌细胞中。恢复miR-218的表达,可通过负性调控Robo1抑制胃癌的侵袭和转移。4.在胃癌中miR-218的表达降低主要是由于miR-218-2/Slit3的表达下调引起,而与miR-218-1/Slit2无关。miR-218表达缺失,失去对Robo1的翻译抑制,使Robo1表达上调,通过与Slit2相互作用,促进了胃癌的侵袭和转移。