前言：胃癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤。虽然近年来在其诊治方面取得了一些成绩,但预后仍不理想,我国胃癌的死亡率仍居恶性肿瘤前列。腹膜转移是进展期胃癌根治术后最常见的复发形式,也是胃癌患者最主要的死亡原因。目前,国内外许多学者认为腹膜转移是特殊的肿瘤细胞与腹膜适宜的环境相互作用的结果,涉及粘附、降解、移动、血管生成、免疫逃避等诸多方面。　　 正常腹膜为三层结构:表面为单层间皮细胞层;其下为一薄的连续的胶原纤维层,内含少量基质细胞,最下一层为脂肪组织层。扁平状的间皮细胞呈连续排列,覆盖于盆腹腔各壁的内面及腔内各器官的表面,呈半透明状,薄而光滑,能分泌、表达多种细胞因子、粘附分子及基质成分,是一道天然的机械防御屏障,避免间皮下组织的暴露以及微生物的侵袭。进展期胃癌常发生腹膜转移,而腹膜转移是一个多阶段的过程,在这个过程中,覆盖在腹膜表面的间皮细胞无疑发挥着重要的作用。　　 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)于上世纪90年代初在血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的诱导下从人脐周静脉内皮细胞cDNA文库中首次发现。编码人类CTGF的基因定位于染色体6q23.1,包含5个外显子,4个内含子,CTGF含349个氨基酸。近年来研究发现,CTGF与细胞外基质相互作用,调节多种组织恶性肿瘤的发生发展、血管生成及浸润转移。　　 上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指完全分化的上皮细胞表型改变以后转变成完全分化的间质细胞,通常转变为成纤维细胞或肌成纤维细胞的过程。EMT在正常胚胎发育及组织创伤修复中发挥重要作用,病理状态下EMT主要参与器官纤维化与肿瘤浸润转移。EMT受多种细胞因子调节,其中TGF-β被认为是导致EMT的主要分子。CTGF是TGF-β的下游效应分子,介导了TGF-β的EMT效应。有研究发现CTGF能直接诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生EMT。本研究拟研究CTGF在腹膜间皮细胞EMT过程中的作用,并探讨其对胃癌腹膜转移影响。　　 材料与方法：　　 一、细胞培养和处理间皮细胞系HMrSV5在37℃、5％ CO2、95％湿度温箱中培养,培养液为DMEM加10％体积分数的胎牛血清,含100U/ml青霉素和100ug/ml,贴壁生长,2-3天以1:2传代,通过0.15％胰蛋白酶消化后收集。不同时间用不同浓度重组人CTGF(hCTGF)及肿瘤细胞上清处理问皮细胞,光镜下观察间皮细胞处理后形态变化。　　 二、激光共聚焦显微镜无菌盖玻片经多聚赖氨酸包被后,置于六孔培养板。细胞均匀接种于六孔培养板内(5×105 per well),生长融合至80％时,按实验需要分组,并加入处理因素处理,每组设3个复孔,取盖玻片行免疫荧光染色方法测定HMrSV5细胞钙粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。　　 三、蛋白印记法每组收集5×106细胞,加入细胞裂解液,4℃超声波粉碎,过夜后吸出上清液,4℃10000r/min,离心30min。调整各标本蛋白浓度一致。每孔加样20μg,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离胶电压120V,浓缩胶电压100V。在水浴式转印槽中转膜,将PVDF膜封闭,加入一抗,4℃孵育过夜。然后将膜置于辣根过氧化物酶标记的二抗中,室温孵育2h,TBS沈膜3×5min/次,ECL发光法检测。　　 四、实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time reversetransgript polymase chain reaetion,Real-time RT-PCR)用TRIzol试剂提取细胞总RNA,测定RNA浓度、纯度,根据试剂盒步骤进行Real-time RT-PCR。采用2△CT法比较CT值(Threshold cycle),以GAPDH为内参,相对定量样本靶基因表达水平。每一试验至少重复三次。　　 五、细胞粘附实验将间皮细胞HMrSV5以每孔1×104个细胞铺于96孔板中,不同时间用不同浓度重组人CTGF(hCTGF)及肿瘤细胞上清处理间皮细胞。再加入CFSE标记的BGC823细胞,37℃,5％CO2温箱中培养60min。培养结束后,吸出培养液,PBS缓慢冲洗三次,在荧光酶标读数仪进行荧光值的测定。细胞粘附率=粘附细胞荧光强度-空白组荧光强度/细胞总数荧光强度-空白组荧光强度×100％。并在荧光显微镜下观察粘附情况。　　 六、裸鼠体内成瘤实验取雌性裸鼠15只,分为三组,每组5只。其中一组腹腔注入无血清DMEM,另外一组腹腔注入50ng/ml浓度的CTGF500ul,两周后,取处于对数生长期的胃癌细胞株SGC-7901消化、重悬,调整细胞浓度为1×107/ml,每只裸鼠腹腔内注射胃癌细胞500ul。以上裸鼠6周后拉颈处死,观察腹腔内成瘤及腹水情况。　　 结果：　　 体外实验显示不同浓度CTGF可使腹膜间皮细胞发生形态改变,由原来的椭圆形铺路石样变为长梭形,且排列极性消失。Real-time RT-PCR结果显示CTGF处理过的腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA表达下降,肌纤维细胞标志物α-SMA、Vimentin mRNA表达上升。Western-blot及免疫荧光法测定E-cadherin的蛋白表达下降,α-SMA、Vimentin蛋白表达上升。以上情况表明CTGF可诱导腹膜间皮细胞发生EMT。我们又检测了3种胃癌高转移细胞系SGC7901,BGC823,MGC803及间皮细胞HMrSV5上清中CTGF的含量,发现3种高转移细胞系的CTGF浓度较高,而间皮细胞HMrSV5上清中的CTGF含量很低。我们用SGC7901上清液与间皮细胞共培养,发现E-cadherin mRNA及蛋白表达同样下降;α-SMA、Vimentin mRNA及蛋白表达同样上升;而且间皮细胞形态也变为长梭形。这说明含有较高浓度CTGF的胃癌细胞系上清液也可使腹膜间皮细胞发生EMT。我们应用CTGF-siRNA转染胃癌细胞SGC7901,瞬时转染后收集上清培养间皮细胞,其EMT程度明显降低。同时在SGC7901上清中加入CTGF中和抗体,其EMT现象被部分逆转。通过体外粘附实验,我们发现经过CTGF及胃癌细胞上清处理的腹膜间皮细胞与胃癌细胞的粘附率明显高于正常间皮细胞。裸鼠体内实验我们发现,腹腔注射重组CTGF一段时间的裸鼠较注射DMEM及未注射组的裸鼠体内瘤节结生长及腹水生成明显增多。这说明CTGF可以诱导腹膜间皮细胞发生EMT,而且对胃癌细胞的腹膜转移有促进作用。　　 结论：　　 1.CTGF体外可以诱导腹膜间皮细胞系HMrSV5发生EMT,而且EMT的程度与CTGF的浓度及作用时间有关。　　 2.含有较高浓度CTGF的胃癌细胞系上清液也可使腹膜间皮细胞发生EMT,应用CTGF中和抗体可部分逆转EMT现象。　　 3.经过CTGF及胃癌细胞上清处理的发生EMT的腹膜间皮细胞与胃癌细胞的粘附率明显高于正常间皮细胞。　　 4.腹腔注射CTGF一段时间的裸鼠较注射DMEM及未注射组的裸鼠体内瘤节结生长及腹水生成明显增多。