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目的:
牙周炎是侵犯牙周支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的慢性感染性疾病，由多因素如微生物、宿主免疫反应、环境和遗传危险因素引发，可引起牙周支持组织破坏。牙龈结缔组织中含量最丰富的细胞成分是人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)，可直接与细菌及其代谢产物相互作用，通过维持牙周组织稳定并调节宿主免疫炎症反应而影响牙周炎进展。
菌斑生物膜是牙周炎的始发因素，但牙周组织破坏更为重要的原因是生物膜与宿主免疫炎症反应之间的相互作用。口腔菌群中的红色复合体是已知的导致牙周炎发生的危险因素，其核心成员之一牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)，亦是诱发慢性牙周炎的重要病原菌。P.gingivalis细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为重要的毒力因子，可诱导HGFs免疫反应并激活核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)信号转导通路，诱导牙周结缔组织中白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8等炎症因子的产生而破坏牙周组织。
西格列汀(Sitagliptin)是一种新型的临床常用的口服降糖药物，其用于Ⅱ型糖尿病的治疗时可单独使用，或与其他药物联合使用，提高疗效。西格列汀除了能够显著降低血糖外，还具有抗炎、抗肿瘤、肾脏保护、心血管保护和促组织再生等多种作用，具有广阔的应用前景。已有相关研究报道，西格列汀可显著降低Ⅱ型糖尿病患者炎症因子的表达，同时在RINm细胞系和H9c2细胞中发挥抗炎作用。但西格列汀是否能影响牙周组织细胞的炎症反应，还需进一步探究。因此，本课题旨在初步探究西格列汀在体外实验中对LPS诱导的HGFs炎症反应的作用，并探讨其潜在的分子机制，为西格列汀应用于牙周炎治疗提供理论依据和实验基础。
实验方法:
1.HGFs分离、培养和鉴定:收集人的健康牙龈组织，通过酶消化法获得HGFs，P3～P5代的HGFs供实验使用，镜下观察细胞形态特征和免疫荧光法鉴定细胞。
2.细胞活性检测:采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK8)检测0、0.1、0.25、0.5、5、10、100、200、500和1000μM西格列汀在24和48h对HGFs活性的影响;同时检测西格列汀(0.1、0.25、0.5μM)与LPS(5μg/mL)共同作用24h、48h对HGFs活性的影响。
3.炎症相关因子表达检测:为了检测西格列汀在不同浓度时对炎症因子的作用，我们将实验分为5组:空白对照(Control)组、脂多糖(LPS)组、脂多糖+0.1μM西格列汀(LPS+0.1)组、脂多糖+0.25μM西格列汀(LPS+0.25)组、脂多糖+0.5μM西格列汀(LPS+0.5)组。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对IL-6,IL-8,趋化因子配体2(C-C motifligand2，CCL2)，超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)的mRNA表达量进行检测;利用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测IL-6，IL-8和CCL2的蛋白表达量。
4.西格列汀对HGFs抗炎机制的探究:本实验分为4组:对照组、LPS组、LPS+西格列汀组、LPS+NF-κB抑制剂BAY11-7082组。蛋白免疫印迹(Western blot)检测NF-κB通路，通过qRT-PCR验证加入BAY11-7082(NF-κB通路抑制剂)后炎症因子mRNA水平上的变化。
结果:
1.HGFs分离、培养和鉴定:利用酶消化法成功分离培养HGFs，细胞免疫荧光结果显示，酶消法获得的HGFs波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。
2.CCK8结果表明，0.1、0.25和0.5μM西格列汀在24和48h对HGFs的增殖无明显影响(P＞0.05)。5～1000μM西格列汀显著抑制细胞增殖(P＜0.001)。单独使用5μg/mLLPS或LPS与0.1、0.25和0.5μM西格列汀共同作用于HGFs24、48h，对细胞增殖无影响(P＞0.05)。
3.西格列汀抑制炎症因子表达:qRT-PCR检测结果表明，在12h和24h西格列汀剂量依赖性地抑制LPS上调的CCL2(P＜0.001)，IL-6(P＜0.01)，IL-8(P＜0.01)和SOD2(P＜0.05)的表达。ELISA结果表明，LPS诱导CCL2、IL-6、IL-8蛋白表达量呈不同程度升高(P＜0.01)，而西格列汀下调HGFs中三种蛋白的表达。
4.西格列汀通过NF-κB信号通路下调炎症因子的表达:Westernblot结果显示，LPS激活NF-κB信号通路，西格列汀可通过抑制p-p65和p-IκBα磷酸化(P＜0.001，P＜0.0001)以及IκBα降解(P＜0.0001)来阻断NF-κB信号通路。为了进一步证明西格列汀抑制炎症因子的表达是通过NF-κB通路，我们还使用5μMNF-κB通路抑制剂(BAY11-7082)处理HGFs，通过qRT-PCR分析IL-6，IL-8，CCL2和SOD2的mRNA水平。结果表明，0.5μM西格列汀抑制LPS上调的CCL2(P＜0.001)，IL-6(P＜0.001)，IL-8(P＜0.001)和SOD2(P＜0.0001)的表达，5μMBAY11-7082组CCL2，IL-6，IL-8和SOD2含量明显减少，差异有显著性(P＜0.0001)。
结论:
本研究结果表明，西格列汀通过阻断NF-κB信号通路的激活来抑制P.gingivalisLPS诱导的HGFs中炎症因子IL-6、IL-8及CCL2、SOD2的表达，为西格列汀应用于牙周炎治疗提供了理论依据和实验基础。
牙周炎是侵犯牙周支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的慢性感染性疾病，由多因素如微生物、宿主免疫反应、环境和遗传危险因素引发，可引起牙周支持组织破坏。牙龈结缔组织中含量最丰富的细胞成分是人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)，可直接与细菌及其代谢产物相互作用，通过维持牙周组织稳定并调节宿主免疫炎症反应而影响牙周炎进展。
菌斑生物膜是牙周炎的始发因素，但牙周组织破坏更为重要的原因是生物膜与宿主免疫炎症反应之间的相互作用。口腔菌群中的红色复合体是已知的导致牙周炎发生的危险因素，其核心成员之一牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)，亦是诱发慢性牙周炎的重要病原菌。P.gingivalis细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为重要的毒力因子，可诱导HGFs免疫反应并激活核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)信号转导通路，诱导牙周结缔组织中白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8等炎症因子的产生而破坏牙周组织。
西格列汀(Sitagliptin)是一种新型的临床常用的口服降糖药物，其用于Ⅱ型糖尿病的治疗时可单独使用，或与其他药物联合使用，提高疗效。西格列汀除了能够显著降低血糖外，还具有抗炎、抗肿瘤、肾脏保护、心血管保护和促组织再生等多种作用，具有广阔的应用前景。已有相关研究报道，西格列汀可显著降低Ⅱ型糖尿病患者炎症因子的表达，同时在RINm细胞系和H9c2细胞中发挥抗炎作用。但西格列汀是否能影响牙周组织细胞的炎症反应，还需进一步探究。因此，本课题旨在初步探究西格列汀在体外实验中对LPS诱导的HGFs炎症反应的作用，并探讨其潜在的分子机制，为西格列汀应用于牙周炎治疗提供理论依据和实验基础。
实验方法:
1.HGFs分离、培养和鉴定:收集人的健康牙龈组织，通过酶消化法获得HGFs，P3～P5代的HGFs供实验使用，镜下观察细胞形态特征和免疫荧光法鉴定细胞。
2.细胞活性检测:采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK8)检测0、0.1、0.25、0.5、5、10、100、200、500和1000μM西格列汀在24和48h对HGFs活性的影响;同时检测西格列汀(0.1、0.25、0.5μM)与LPS(5μg/mL)共同作用24h、48h对HGFs活性的影响。
3.炎症相关因子表达检测:为了检测西格列汀在不同浓度时对炎症因子的作用，我们将实验分为5组:空白对照(Control)组、脂多糖(LPS)组、脂多糖+0.1μM西格列汀(LPS+0.1)组、脂多糖+0.25μM西格列汀(LPS+0.25)组、脂多糖+0.5μM西格列汀(LPS+0.5)组。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对IL-6,IL-8,趋化因子配体2(C-C motifligand2，CCL2)，超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)的mRNA表达量进行检测;利用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测IL-6，IL-8和CCL2的蛋白表达量。
4.西格列汀对HGFs抗炎机制的探究:本实验分为4组:对照组、LPS组、LPS+西格列汀组、LPS+NF-κB抑制剂BAY11-7082组。蛋白免疫印迹(Western blot)检测NF-κB通路，通过qRT-PCR验证加入BAY11-7082(NF-κB通路抑制剂)后炎症因子mRNA水平上的变化。
结果:
1.HGFs分离、培养和鉴定:利用酶消化法成功分离培养HGFs，细胞免疫荧光结果显示，酶消法获得的HGFs波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。
2.CCK8结果表明，0.1、0.25和0.5μM西格列汀在24和48h对HGFs的增殖无明显影响(P＞0.05)。5～1000μM西格列汀显著抑制细胞增殖(P＜0.001)。单独使用5μg/mLLPS或LPS与0.1、0.25和0.5μM西格列汀共同作用于HGFs24、48h，对细胞增殖无影响(P＞0.05)。
3.西格列汀抑制炎症因子表达:qRT-PCR检测结果表明，在12h和24h西格列汀剂量依赖性地抑制LPS上调的CCL2(P＜0.001)，IL-6(P＜0.01)，IL-8(P＜0.01)和SOD2(P＜0.05)的表达。ELISA结果表明，LPS诱导CCL2、IL-6、IL-8蛋白表达量呈不同程度升高(P＜0.01)，而西格列汀下调HGFs中三种蛋白的表达。
4.西格列汀通过NF-κB信号通路下调炎症因子的表达:Westernblot结果显示，LPS激活NF-κB信号通路，西格列汀可通过抑制p-p65和p-IκBα磷酸化(P＜0.001，P＜0.0001)以及IκBα降解(P＜0.0001)来阻断NF-κB信号通路。为了进一步证明西格列汀抑制炎症因子的表达是通过NF-κB通路，我们还使用5μMNF-κB通路抑制剂(BAY11-7082)处理HGFs，通过qRT-PCR分析IL-6，IL-8，CCL2和SOD2的mRNA水平。结果表明，0.5μM西格列汀抑制LPS上调的CCL2(P＜0.001)，IL-6(P＜0.001)，IL-8(P＜0.001)和SOD2(P＜0.0001)的表达，5μMBAY11-7082组CCL2，IL-6，IL-8和SOD2含量明显减少，差异有显著性(P＜0.0001)。
结论:
本研究结果表明，西格列汀通过阻断NF-κB信号通路的激活来抑制P.gingivalisLPS诱导的HGFs中炎症因子IL-6、IL-8及CCL2、SOD2的表达，为西格列汀应用于牙周炎治疗提供了理论依据和实验基础。