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1.目的:建立重组腺病毒的扩增及滴度测定的有效方法,为进一步应用重组腺病毒缺氧诱导因子-1α(AdHIF-1α)对大鼠脑缺血缺氧的基因治疗打下基础。 方法:应用人胚肾293细胞作为包装细胞,将AdHIF-1α/Ad转入293细胞,将293细胞包装出重组腺病毒AdHIF-1α/Ad,于荧光显微镜下观察绿色荧光以确定转染结果。用293细胞包装并扩增下一步实验所需的重组腺病毒,用GFP及有限稀释法进行病毒滴度测定。 结果:将重组腺病毒质粒转染293细胞后,于荧光显微镜下均可观察到明确的绿色荧光,扩增的AdHIF-1α的滴度:8.4×108pfu/mL,Ad的滴度:9.6×108pfu/mL。 结论:通过培养293细胞,可成功扩增重组腺病毒AdHIF-1α;病毒液量可完全满足体内基因转染实验的需要。 2.目的:探讨重组腺病毒缺氧诱导因子-1α基因对大脑皮质神经元细胞缺氧的保护作用及机制,为临床治疗缺血性脑血管病提供更多的实验依据。 方法:制备体外培养大鼠大脑皮层神经细胞缺氧模型,分为正常对照组、缺氧组、重组腺病毒 AdHIF-1α基因治疗组、重组腺病毒空载体组,并将其四组分为四个时间点12h,24h,48h,72h,选择多项观察指标包括倒置显微镜下观察正常和缺氧神经细胞的生长情况及免疫组化观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、微血管内皮细胞生长因子(VEGF)、人促红细胞生成素(EPO)在神经元细胞的表达变化;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)观察HIF-1α、VEGF、EPO等mRNA在神经元细胞中的表达;酶联免疫学检测(ELISA)法观察HIF-1α、VEGF、EPO在神经元细胞中的浓度;流式细胞仪观察AdHIF-1α转染后神经元细胞凋亡的变化。 结果: (1)初种神经细胞12h开始贴壁,72h后可见大部分细胞贴壁,细胞形态比较单一呈圆球形,偶见细胞长出突起。第5天神经元中混杂较多胶质细胞,换N2培养液抑制杂质细胞的生长,培养至第11天,神经细胞生长旺盛,神经细胞纯化达95%以上。 (2)缺氧模型的建立:用于实验的神经细胞,换用含100umol/l Cocl2的2%FBS的DMEM培养液分别继续培养12h,24h,48h,72h经过形态学观察和缺氧模型预实验,缺氧24小时适合用作缺氧模型。 (3)免疫组化观察:神经元细胞在一般培养状态下HIF-1α、VEGF、EPO相关蛋白表达均较弱,缺氧后HIF-1α、VEGF、EPO均呈阳性表达,与正常对照组相比表达显著增高,差异有显著性,在缺氧处理24h后加入重组腺病毒HIF-1α均可提高HIF-1α、VEGF、EPO的表达,与缺氧组比较差异有显著性,但重组腺病毒空载体组与缺氧组之间比较无统计学意义。 (4)逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)观察HIF-1α、VEGF、EPO等mRNA在神经元细胞中的表达,经AdHIF-1α基因治疗组各时间点的表达明显增加,与缺氧组相比有明显的差异,Ad组与缺氧组相比无统计学意义。 (5)流式细胞仪凋亡细胞记数:缺氧后凋亡的细胞增加,和正常组比较差异有显著性,经AdHIF-1α基因治疗后凋亡数明显减少,与缺氧组比较差异均有显著性,Ad组与缺氧组之间比较无统计学意义。 (6)酶联免疫学检测(ELISA)法观察HIF-1α、VEGF、EPO在神经元细胞中的浓度:经AdHIF-1α基因治疗后浓度明显增加与缺氧组相比有明显的差异,Ad组与缺氧组相比无统计学意义。 结论:本实验建立的神经元细胞培养模型及细胞缺氧模型是成功的,可用于脑缺血缺氧的体外实验的研究;AdHIF-1α对大鼠的大脑皮质神经元细胞有保护作用。机制是外源性HIF-1α基因促使其靶基因VEGF及EPO的表达上调,从而发辉脑保护作用。