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肺癌是当前世界上的最常见恶性肿瘤之一,其发病率和死亡人数在我国位于所有肿瘤首位。尽管外科手术、化疗、放疗、分子靶向药物治疗等治疗方式的不断发展,但中晚期肺癌的疗效并不理想,预后较差。近年来兴起的免疫疗法则主要通过增强机体的免疫应答达到抗肿瘤作用,具有敏感性高、特异性强的特点,被认为是最有希望的中晚期肺癌治疗策略。肿瘤疫苗不但能预防肿瘤的发生,而且还可以用于肿瘤的治疗,是重要的肿瘤免疫治疗策略之一。大量的研究证实,CD4/CD8+T细胞免疫应答是机体的免疫系统监视和抑制肿瘤的最主要效应机制,因此是设计有效肿瘤疫苗的重要依据。然而目前并无较理想的肿瘤疫苗。究其原因,可能与机体的免疫耐受抑制肿瘤疫苗诱导强烈的CD4/CD8+T细胞免疫应答有关。因此,寻找能够有效诱导机体CD4/CD8+T应答的肿瘤疫苗载体是目前研究的焦点。鉴于疟原虫遗传减毒子孢子(GAS)可以克服机体免疫耐受,并高效诱导疟原虫特异性CD8+/CD4+T细胞反应,本项目以遗传减毒子孢子作为载体,构建表达主要肺癌相关抗原MAGE-A3的重组遗传减毒子孢子疫苗,观察能否活化MAGE-A3特异性CD4/CD8+T细胞,以达到抗肺癌的作用,并进一步探讨相关机制,这可为设计有效的肺癌等肿瘤疫苗提供新思路。一、利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达MAGE-A3的疟原虫减毒子孢子为了探讨表达肺癌相关抗原MAGE-A3的重组遗传减毒子孢子是否具有抗肺癌的作用,本研究拟利用CRIPSR-cas9技术对伯氏疟原虫ANKA株(P.b ANKA)子孢子UIS3基因序列替换成肺癌相关抗原MAGE-A3,从而获得能够成功入侵肝细胞但不能在体内继续增殖发育,而且能够表达MAGE-A3的重组遗传减毒子孢子(GAS/MAGE-A3)。按照厦门大学袁晶教授的文章报道的实验方法,设计并构建用于编辑疟原虫基因组的CRIPSR-cas9重组质粒(PYC质粒)。然后通过电转、药物筛选等方式筛选出阳性单克隆重组子孢子。1、利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PYC/MAGE-A3重组质粒根据PYC质粒以及P.b ANKA株UIS3基因序列特点,设计并合成sgRNA序列,随后通过退火成功连接至PYC质粒BsmBI位点上。然后从P.b ANKA株基因组中扩增UIS3基因的5’UTR和3’UTR序列,从A549人肺腺癌细胞系中扩增肺癌相关抗原MAGE-A3序列,随后将三个片段通过重叠PCR、无缝克隆等方式插入到PYC质粒的多克隆位点上。最后酶切及测序结果显示所有片段均插入到正确位置,并未发现碱基突变。2、通过电转、药物筛选等方式成功获得GAS/MAGE-A3重组减毒子孢子将P.b ANKA株疟原虫和构建的PYC质粒混合电转后通过尾静脉注射至小鼠体内,24h后开始用8ug/mL乙胺嘧啶溶液进行药物筛选,持续给药至原虫血症重新出现,开始进行单克隆筛选,按照每只小鼠接种1条疟原虫稀释接种,接种后第六天开始出现原虫血症,30只小鼠中共7只出现原虫血症,对出现原虫血症的单克隆小鼠提取的gDNA进行PCR以及测序鉴定,结果显示其中1只为电转成功的阳性单克隆疟原虫。3.GAS/MAGE-A3重组减毒子孢子成功的转录并翻译MAGE-A3重组蛋白为了验证转基因疟原虫是否能够转录并翻译肺癌抗原MAGE-A3,我们提取了重组疟原虫子孢子RNA,然后将其进行逆转录的cDNA进行扩增,成功扩增出MAGE-A3序列的950bp的条带,说明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功转录。然后将分离纯化的重组疟原虫子孢子入侵HepG2细胞,24h后采用间接免疫荧光对HepG2细胞中MAGE-A3蛋白的表达进行观察。结果发现转基因疟原虫子孢子纳虫空泡中出现MAGE-A3蛋白,而野生型疟原虫却不表达MAGE-A3蛋白,说明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功表达。二、表达MAGE-A3的疟原虫减毒子孢子抗肺癌免疫效果及机制研究为了探讨表达肺癌相关抗原MAGE-A3的重组遗传减毒子孢子能否诱导小鼠CD4+/CD8+T细胞应答,以达到抗肺癌作用。本实验用PBS、GAS、GAS/MAGE-A3分别多次尾静脉注射免疫HLA-A2小鼠,末次免疫后7天分别检测各组小鼠外周血及脾脏CD4+/CD8+T细胞反应,然后采用Elispot检测分泌IFN-γ的MAGE-A3特异性CD8+T细胞。然后将分离收集的免疫小鼠脾脏的CD8+T细胞过继到皮下接种A549的裸鼠体内,观察其抗肺癌效果。1、GAS/MAGE-A3重组遗传减毒子孢子成功诱导小鼠CD4+/CD8+T细胞反应小鼠末次免疫后7天,FACS分别检测外周血及其脾脏的CD4+/CD8+T细胞频率,结果显示相较于PBS组,GAS/MAGE-A3组和GAS组都能明显诱导外周血及其脾脏的CD4+/CD8+T细胞应答,且CD8+T细胞活化更加明显。然后分离收集脾脏CD8+T细胞进行Elispot检测MAGE-A3特异性CD8+T细胞,结果显示GAS/MAGE-A3组明显活化了MAGE-A3特异性CD8+T细胞,而GAS组和PBS组均未发现。2、GAS/MAGE-A3重组子孢子诱导的CD8+T细胞具有显著抗肺癌的作用为了探讨GAS/MAGE-A3重组遗传减毒子孢子诱导的CD8+T细胞是否具有抗肺癌的作用,在末次免疫后7天分离收集小鼠脾脏的CD8+T细胞,然后过继到已经皮下接种A549细胞的裸鼠体内,按照5×106/只,每1周一次,共注射三次,观察是否具有抑制A549皮下瘤的增殖,达到抗肺癌的效果。结果发现,GAS/MAGE-A3组能够有效抑制A549皮下瘤的增殖,并明显延长小鼠的生存期,这说明MAGE-A3特异性的CD8+T细胞在抑制A549增殖起到主要作用。3.GAS/MAGE-A3重组遗传减毒子孢子通过抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡以及抑制血管生成诱导抗肿瘤效应肿瘤生长60天后,取出肿瘤并用多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后,用Ki-67抗体、Tunel凋亡检测试剂盒、CD31抗体,分别检测肿瘤的增殖、凋亡及血管生成情况。结果发现GAS/MAGE-A3重组遗传减毒子孢子显著抑制了肿瘤的增殖及血管生成,促进了肿瘤细胞的凋亡。综上所述,相比于传统的基因编辑技术,CRISPR/Cas9技术在疟原虫基因编辑上表现出高效、简便等优势。GAS/MAGE-A3重组遗传减毒子孢子不仅可以有效诱导CD4+/CD8+T细胞反应,还可以活化MAGE-A3特异性CD8+T细胞。GAS/MAGE-A3诱导的CD8+T细胞可以有效抑制A549细胞的增殖,延长小鼠的生存期,其中MAGE-A3特异性CD8+T细胞起到主要作用。