心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命和生活质量唯一有效的治疗手段。然而,心脏移植过程中缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)和供心冷保存时限较短的问题,一直是困扰心脏移植推广应用的主要瓶颈。心脏移植过程中,供心必然经历缺血缺氧-再灌注重新获氧这一过程,导致组织损伤和炎症反应。IRI是供心术后急、慢性功能不全甚至功能衰竭,致使死亡率上升的主要因素。目前临床通常使用冷保存液灌注和保存离体供心,然而,在此低温条件下的心肌代谢并未停止,有害代谢产物的积聚最终会在再灌注阶段引起供心损伤。目前该法的心肌有效保存时限仅有4~6 h,进一步加剧了待移植患者与供心不足的矛盾。由此可见,研制可减轻IRI和延长供心冷保存时限的冷保存液,是心脏移植的重要技术关键和研究热点。IRI诱导多条信号通路的激活并调控一系列基因的表达,导致细胞凋亡坏死最终引起器官损伤,业已证明:细胞凋亡、补体激活和炎症皆为参与IRI的经典关键通路。研究发现将针对上述通路中关键基因的化学合成小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)加入器官保存液,可有效抑制IRI所致的器官损伤,然而,这些研究仅局限于小动物模型,很难客观模拟人类疾患过程。猪在解剖结构、生理生化和免疫反应等方面与人类极为相似,是学术界公认的最适合模拟人类心血管系统疾病的模型动物。有鉴于此,我们以小型猪为实验动物,根据RNA干扰理论,研制可减轻IRI和延长有效保存时限的含siRNA心肌保存液。在siRNA体内给药中,转染效率一直是个技术难点。小动物实验证明,大剂量裸siRNA分子加入保存液可有效减少IRI,但大剂量siRNA给药策略不适用于大动物或人医临床。而转染试剂(Transfection reagent,TR)广泛应用于siRNA的体内和体外转染中,可减少siRNA使用剂量,较适合临床给药。为此,我们选取IRI相关的4个基因:Complement component 3(C3)(补体激活)、Nuclear Factor kappa B-p65(p65)(炎症)、Caspase 8和Caspase 3(细胞凋亡),设计并合成siRNA,用猪肾细胞(PK15)和猪睾丸细胞(ST)筛选出抑制效率最强的4对siRNA。再将不同剂量化学修饰的siRNA-TR混合物或单纯siRNA加入常规心脏保存液Celsior液中,灌注并冷保存离体猪心。研究发现含低剂量siRNA-TR的保存液(4 OD siRNA-TR)在抑制4个目的基因表达和减少细胞凋亡作用上均优于只含有高剂量单纯siRNA的保存液(16 OD siRNA)。为减少和降低供心离体冷保存和再灌注引起的组织损伤和功能障碍,我们研究发现含siRNA-TR的保存液可减少冷保存供心的凋亡细胞,但其对再灌注复跳心的作用尚不清楚。为此,我们设计和构建了大动物供心保存评价体系,在国内率先建立大动物离体心灌流系统,通过灌注温血灌流液可使各类大动物供心在离体情况下跳动,再与心脏原位移植模型结合,构成供心体内外各项主要生物学参数综合评价平台。保存后供心在连接于离体心灌流系统或原位移植到受体时,经监测复跳过程中左心室血流动力学参数、心肌生存率、组织结构改变、心肌坏死、氧化应激、免疫激活和炎症反应等一系列生物学参数,可全面客观评判不同保存方式保存后的供心质量,为大动物心功能监测和人医心血管疾病临床相关研究奠定了坚实的研究基础和技术平台。为检验含siRNA-TR的保存液对再灌注猪心的保护效果,使用500 ml含2、4、6 OD siRNA(siRNA组)或4 OD scramble siRNA(阴性对照组,Ctrl)与TR混合物的Celsior液,以及500 ml单纯Celsior液(常规保存组,CEL),灌注并冷保存离体猪心12 h后再将供心连接于体外灌流系统,温血灌注供心以左心做功模式跳动3 h。结果发现:siRNA组供心做功血流动力学参数均好于对照组CEL和Ctrl;做功结束后,其组织细胞凋亡水平低;组织结构改变轻微;血浆中的心肌酶学标志物和组织中的氧化应激标志物水平低;心肌组织中促炎因子和4个靶蛋白表达下调;组织中TLR-7及其配体MyD88水平未见升高。3个siRNA组之间相比,4 OD组综合效果最好,与冷保存未复跳猪心试验结果一致。从而提示siRNA保存液具有保护心功能、抑制细胞凋亡、保护心肌正常组织结构、减轻心肌坏死和氧化应激、控制炎症反应的作用且具备良好的生物安全性。基于离体心试验结果,为证实4 OD-TR的siRNA保存液在原位移植中同样具有较好心肌保护效力,我们将6只成年雄性小型猪供心分为2组,常规保存组供心冷保存6 h,而灌注siRNA-TR保存液的供心冷保存时间延长到12 h。冷保存结束后全部原位移植到受体胸腔并开放主动脉使其复跳做功3 h,期间记录血流动力学参数。所有供心冷停跳后、检测与离体心复跳心相同的指标。结果发现,与常规冷保存6 h的供心相比,延长保存时间到12 h的供心在凋亡水平、组织结构变化、心肌坏死、炎症反应和先天免疫激活等方面都有所减轻,心功能参数良好。在延长一倍时间的基础上,仍具有比常规临床保存供心更好的质量参数。本研究证明:通过含抑制炎症和凋亡途径的siRNA心肌保存液冷保存猪供心,能有效提高供心质量和延长保存时限,为深入研发临床新型供心保存液提供了新思路和新途径,具有广阔的应用前景和潜在的开发价值。