原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,目前尚无根治方法。自杀基因疗法,又名基因介导的酶-前药疗法,能特异性提高药物在肿瘤中的浓度,并具备独特的旁观者效应,是肿瘤基因治疗的重要方法之一。本研究将木薯来源的linamarase(lis)引入肝癌基因治疗中,利用其水解前体药物linamarin(lin),并产生毒性代谢产物HCN的特性,从而实现对肝癌细胞的杀伤。通过建立lis稳转肝癌细胞系,发现其本身对细胞生长,细胞周期等特性并无影响。此外单独使用前体药物lin也未发现细胞毒性,从而提示了该策略的安全性。为提高目的基因的表达及针对肝癌的靶向性,我们以ViraPower?病毒载体系统为基础,分别构建CMV及AFP启动子转录的lis腺病毒载体。体外实验表明,含CMV启动子的腺病毒联合lin具备针对多种肿瘤细胞的强大抑制效应及旁观者效应。而含AFP启动子的病毒仅具备对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,从而体现了其针对肝癌的特异性和靶向性。动物实验提示lis能特异性表达于肝癌组织中,联合使用lin后能显著抑制肿瘤生长并延长动物存活时间。结果表明,lis/lin系统是一种潜在的肝癌基因治疗策略,值得进一步深入研究。目的:1.构建稳定转染lis基因的肝癌细胞系,实现lis酶在真核细胞中的活性表达,观察它对肿瘤细胞的体内、体外生物学特性的影响。初步了解lis基因及lin对肝癌细胞的作用;2.运用ViraPower?腺病毒载体系统,构建CMV启动子转录下的lis重组腺病毒载体,观察该病毒载体的感染效率及目的基因表达情况。应用重组病毒联合前体药物lin进行多种肿瘤细胞系的体内、体外治疗,探讨腺病毒载体介导的lis/lin系统的抑瘤效果及作用机理;3.克隆AFP启动子,检测其靶向转录活性。构建AFP启动子转录的lis重组腺病毒,通过体外实验及裸鼠荷瘤实验来检验该病毒前药体系针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,实现lis/lin系统治疗原发性肝癌转录水平上的靶向调控。方法:1.PCR法从木薯cDNA中克隆并扩增lis cDNA,将该基因亚克隆至pcDNA3.1+质粒中,构建重组真核表达载体。脂质体转染及药物筛选相结合,构建稳定转染lis肝癌细胞系HepG2/lis。观察稳转细胞形态学变化,生长曲线,流氏细胞周期,裸鼠体内成瘤曲线等,并进行肿瘤细胞内lis酶活性分析。用不同浓度的lin培养HepG2细胞,观察lin本身对HepG2细胞生长的影响及细胞毒性;2.将lis cDNA亚克隆于ViraPower?腺病毒载体系统的入门克隆pENTRTM2B中,利用特异性LR反应将入门克隆中的lis导入腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST中(含CMV启动子) ,获得重组病毒骨架载体pAd/CMV/lis。线性化骨架载体并转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-CMV-lis。扩增并纯化重组腺病毒,TCID50法测定它的滴度。利用含报告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞,摸索病毒的最佳感染复数。通过联合Ad-CMV-lis及前药lin进行多种肿瘤细胞系的体外及体内抑瘤实验,观查该系统的抑瘤活性及旁观者效应。用DNA片段化检测、Annexin-V/PI流式细胞分析、瘤组织病理学及TUNEL染色进一步探索lis/lin系统的抑瘤机理。3.RT-PCR法从HepG2(AFP+)细胞基因组中克隆并扩增AFP启动子,亚克隆入pEGFP-1质粒中,利用报告基因EGFP检测其特异性转录活性。用AFP启动子替换pcDNA3.1+质粒中的CMV启动子,然后将lis cDNA插入该质粒多克隆位点中,实现AFP启动子与lis的串联。通过构建病毒入门载体及LR反应,将AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架载体中(不含启动子),获得骨架载体pAd/AFP/lis。将其转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AFP-lis。重组病毒经扩增、纯化后,联合lin进行体内、体外抑瘤实验,验证该体系对AFP阳性肿瘤细胞的特异性及靶向性杀伤。结果:1.成功构建lis稳转肝癌细胞系HepG2/lis。发现它与空质粒转染组及空白对照细胞相比,在细胞形态,生长曲线,细胞周期分布,体内成瘤生长曲线等方面差异不显著(P>0.05)。HepG2/lis细胞给予lin后,能产生代谢产物HCN,并随lin浓度的增加而增多,提示lis酶在真核细胞中能以活性方式表达。此外单独使用lin对细胞生长并无抑制作用。2.成功构建重组腺病毒Ad-CMV-lis。联合应用lin后能在体内、体外有效抑制多种肿瘤细胞的生长,抑瘤作用与lin呈明显的时间、剂量依赖效应。肿瘤细胞治疗后经DNA片段化检测未发现典型的凋亡DNA ladder, Annexin-V/PI流式细胞分析提示经治疗后凋亡及坏死细胞均增高,但以坏死细胞增高为主。瘤组织病理学观察发现Ad-CMV-lis/lin治疗组中出现大量的坏死区,并发现较多的TUNEL阳性染色细胞。3.克隆并重组了276bp的AFP启动子。EGFP报告基因分析提示,该启动子具备AFP阳性肝癌细胞的特异性转录活性。成功构建AFP启动子转录下的重组腺病毒Ad-AFP-lis,实现了lis在AFP阳性肝癌细胞系中的高效特异性表达。体外及动物治疗实验均证明,该病毒联合lin治疗,能特异性抑制AFP阳性肝癌细胞系的生长,并延长动物存活时间,而对AFP阴性肝癌细胞系无杀伤效果。结论:1.植物来源的lis cDNA能稳定表达于真核细胞中,并能正确包装出类似大小,具备β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。lis cDNA在细胞中的稳定整合对细胞形态、生长特性、细胞周期、成瘤性等生物学特点并无明显影响。而前体药物lin对细胞也具有低毒性,因此lis/lin系统是一种安全的自杀基因治疗策略。2.通过重组腺病毒载体,发现腺病毒具有靶细胞感染率及目的基因表达水平高,包装使用方便,病毒滴度高,不整合到宿主基因组中等优点,因此能作为lis/lin自杀基因治疗的高效表达载体。3.重组腺病毒Ad-CMV-lis在体内、体外均表现出对多种肿瘤细胞系的抑制作用,提示lis/lin自杀基因系统具备较广的治疗适用范围。由于不同肿瘤的生物学特点不同,因此该系统在其他肿瘤中的应用潜能有待于进一步研究。4. 276bp的AFP启动子能调控lis/lin系统在肝癌中的靶向性转录,实现针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤。然而由于原发性肝癌中有少部分呈AFP阴性表达,因此改造现有的AFP启动子,提高其针对AFP阴性的肝癌细胞的转录水平,是值得深入研究的问题。