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目的: PSD-95(postsynaptie density protein95)是谷氨酸能兴奋性突触传递中重要的脚手架蛋白,它可以锚定、募集NMDA受体及其调节分子,在脑损伤病理机制中有重要意义。本室前期研究结果表明,脑缺血引起PSD-95酪氨酸磷酸化,这一磷酸化作用Src/Fyn所介导,主要的磷酸化位点是Y523;PSD-95Y523的磷酸化可增强NMDA受体的功能。本研究旨在探讨PSD-95Y523磷酸化是否能增强NR2A酪氨酸磷酸化水平,从而上调NMDA受体功能的分子机制。
方法:采用传代培养的HEK293T细胞,通过脂质体转染质粒的方法,运用蛋白质免疫共沉淀和免疫印迹技术,观察PSD-95Y523酪氨酸磷酸化对内源性Src激酶活性、NR2A酪氨酸磷酸化的影响,探究NR2A-PSD-95-Src和Src-PSD-95-Pyk2的相互联系,并采用免疫荧光技术分析NR2A的膜定位情况。采用分子克隆手段,分别构建了不同构型的Src真核表达载体。
结果:
1.在HEK293T细胞中单转染PSD-95WT或是突变体PSD-95Y523F和PSD-95Y533F,PSD-95Y523F组SrcY416的磷酸化水平低于PSD-95WT组。
2.在HEK293T细胞中共转染NRI/NR2A/PSD-95WT或是突变体PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95Y523F组NR2A酪氨酸磷酸化水平低于PSD-95WT组。
3.并且,PSD-95WT的酪氨酸磷酸化促进了Src-PSD-95-NR2A的三者的相互作用,而PSD-95Y523F组则低于PSD-95WT组。
4.在HEK293T细胞中共转染活化型Src/PSD-95WT或是其突变体PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT和PSD-95Y523F对组成型活化的Src激酶Y416的磷酸化无明显影响。
5.在HEK293T细胞中共转染Pyk2/PSD-95WT或是其突变体PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT酪氨酸磷酸化促进了Pyk2对Src激酶的活化,而PSD-95Y523F组则低于PSD-95WT组。
6.在HEK293T细胞中共转染NR1/Nr2A/PSD-95WT或是突变体PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT和PSD-95Y523F组NR2A在细胞膜上的量无明显区别。
结论:
1.PSD-95Y523磷酸化参与Src激酶和NR2A磷酸化水平的上调。
2.PSD-95Y523磷酸化可促进Pyk2对Src的激活作用。
3.PSD-95Y523磷酸化对NMDA受体功能的上调作用,主要是通过上调NR2A的酪氨酸磷酸化水平来实现的。