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糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的内分泌代谢紊乱疾病,临床主要表现为高血糖、高血脂和进行性肾功能损伤。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是由DM导致的一种严重的和危害性最大的微血管慢性并发症,也是造成终末期肾衰(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因之一。小檗碱(berberine,BBR),目前主要用于治疗肠道感染如腹泻,BBR除了作为植物抗菌素外,还具有降低增高的血糖水平,调节血脂水平,具有内皮依赖性舒张血管作用,同时也具有减轻肾脏炎症反应,降低胰岛素抵抗等肾脏保护作用作用。足细胞(Podocyte),主要通过足细胞足突黏附于肾小球基底膜,足细胞与内皮细胞、肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)共同构成肾小球滤过屏障,一起保持维持正常的肾小球滤过功能。以上表明：BBR对DN大鼠肾脏有一定的保护作用,DN的发生发展与足细胞损伤有着紧密的联系,足细胞损伤或脱落与足细胞特征蛋白nephrin、podocin及黏附分子α3p1整合素等蛋白的异常表达密切相关,因此探究足细胞表面特征蛋白的异常表达与足细胞损伤之间的联系及BBR的影响对防治DN具有重要的临床价值意义,但目前它们之间的内在联系尚不清楚。本研究以DN模型大鼠为研究对象,观察BBR对大鼠整体指标的变化以及足细胞特征性蛋白在肾脏皮质组织中的表达；同时探讨了BBR对高糖和TGFβ1共同诱导的足细胞损伤的改善作用及其可能机制。目的：在整体实验中,观察DN大鼠肾脏整体指标的改变及足细胞表面特征蛋白nephrin、podocin及黏附分子α3β1整合素表达变化,探讨BBR对DN大鼠肾脏的保护作用方式及部分机制；在细胞实验中,通过高糖和TGFβ1共同诱导的足细胞损伤,进一步检测足细胞表面特征蛋白、p-Akt和ILK蛋白的表达情况,探究BBR发挥对DN大鼠肾脏保护作用与PI3K/Akt通路的内在联系,为合理利用BBR防治DN提供理论依据。方法：以SD大鼠为对象,采用高糖高脂饲料联合低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,35mg/kg)来进行诱导,将72h后空腹血糖值≥11.1mol/L大鼠纳入实验组,实验分组如下：将造模成功大鼠随机分成以下6组(每组10只大鼠)：糖尿病肾病大鼠(DN)组；BBR低剂量给药组(50mg/kg); BBR(100mg/kg)中剂量给药组；BBR(200mg/kg)高剂量给药组,二甲双胍(1 mg/kg)给药组和卡托普利(15mg/kg)给药组,继续喂以高糖高脂饲料。另设一组正常对照组(NC组),喂以正常饲料。测定DN大鼠整体指标,包括血糖值,肾功能指标,肾脏病理学检查(HE染色和PAS染色),肾小球超微结构的观察；免疫组化法检测肾皮质nephrin、podocin及α3β1整合素蛋白分布和表达情况,WB法法检测肾皮质nephrin、podocin、α3β1整合素蛋白、p-Akt、Akt、ILK和TGFβ1RI的表达水平；体外实验以足细胞为研究对象,相关实验分组为：正常对照组(5.5 mmol/L glucose,NG group),高糖+TGFβ1刺激组(30 mmol/L glucose+5ng/mL TGFβ1, HG+TGFβ1 group),同时设置BBR给药组(15μM,30μM和60μM),PI3K/Akt通路抑制剂LY294002干预组(HG+TGFβ1+LY294002 (40μM) group);形态观察法、免疫荧光法和免疫组化法鉴定足细胞,细胞黏附实验测定足细胞的黏附功能,ELISA法检测BBR给药后对肾小球系膜细胞上清TGF-β1表达水平的影响,蛋白芯片法检测肾小球系膜细胞上清炎症因子表达水平,激光共聚焦法检测足细胞TGFβRI和TGFβRII表达和分布情况；流式细胞术检测足细胞凋亡情况及BBR的影响；Western Blot法检测上足细胞相关蛋白的表达情况及BBR的影响。结果：1.BBR对DN大鼠整体指标的影响与NC组相比,DN模型组大鼠的血糖水平及血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,SCr)水平显著升高,BBR(100mg/kg, 200mg/kg)剂量组能够显著降低大鼠血糖水平以及BUN、SCr水平；HE和PAS染色结果显示：BBR(100mg/kg和200mg/kg)用药组可不同程度改善DN大鼠肾脏异常改变,肾小球基底膜增生明显减弱,细胞外基质沉积减少；电镜观察结果显示：GBM结构较清晰,其不规则增厚明显减轻,足细胞足突融合减少,但仍见部分足突结构节段融合,排列紊乱。2.BBR对DN大鼠肾脏组织nephrin、podocin、α3β1整合素蛋白、p-Akt、Akt、ILK和TGFβRI蛋白分布和表达的影响正常组肾脏组织nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白均匀分布于肾小球足细胞,与NC组相比,DN模型组大鼠肾脏nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白表达水平显著下降,p-Akt、ILK和TGFβRI的蛋白表达水平明显升高；BBR(100和200 mg/kg)用药组能显著上调下降的nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白表达作用；BBR高剂量(200mg/kg)给药组能显著降低p-Akt表达水平,BBR中、高剂量(100和200mg/kg)给药组能够明显降低ILK和TGFβRI蛋白的表达水平。3.足细胞的鉴定结果明场显微镜观察结果：镜下观察培养的细胞传代后生长初期为无明显突起细胞,紧密排列呈鹅卵石样外观,3-5天后,可见部分细胞胞浆伸展,细胞胞间有明显足突突起,足突间互相连接,后生长逐渐融合,生长迟缓,同时培养的细胞对GLEPP1、podocin、nephrin和α3β1整合素蛋白染色表达呈阳性,对Desmin蛋白的表达呈阴性,由此可推断出该细胞为足细胞。4.BBR对足细胞黏附能力和凋亡情况的影响HG+TGFβ1共同刺激能够明显降低足细胞黏附功能；与正常组相比,HG+TGFβ1刺激组能够显著增加足细胞的凋亡率,BBR(30和60μM)用药组能够明显降低足细胞凋亡率。5.肾小球系膜细胞上清炎症因子表达水平在体外培养条件下,DN肾小球系膜细胞分泌的TGFβ1、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1水平显著升高,IL-α、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ的表达水平没有明显变化。6.BBR对足细胞表面特征蛋白nephrin、podocin、α3β1整合素蛋白表达的影响与正常组相比,HG+TGFβ1刺激组能显著降低足细胞内nephrin、podocin和黏附分子α3β1的表达水平,而BBR高浓度用药组(60μM)和LY294002处理组能够明显提高足细胞内nephrin、podocin和黏附分子α3β1的表达水平,BBR中浓度用药组(30μM)能升高足细胞内α3β1整合素的表达水平。7.BBR对足细胞p-Akt、Akt、ILK和TGFβRI蛋白表达的影响与正常组相比,HG+TGFβ1刺激组能显著提高足细胞内p-Akt的表达水平,而BBR(60μM)用药组和LY294002处理组能够明显降低p-Akt的表达水平；与正常组相比,HG+TGFβ1刺激组均能显著提高足细胞内ILK和TGFβRI的表达水平,而BBR用药组(30μM和60μM)能够明显降低足细胞内ILK和TGFβRI的表达水平,而LY294002处理组对ILK和TGFβRI表达水平影响不显著。结论：1.BBR(100和200mg/kg)能够改善DN模型大鼠整体指标,上调DN大鼠肾皮质组织中足细胞表面特征蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白的表达量,提示BBR发挥肾脏保护作用可能与改善足细胞损伤有关；2.DN环境下,肾小球系膜细胞能分泌过量TGFβ1、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1等炎性细胞因子,这些炎性细胞因子可能与加速足细胞损伤有关；3.BBR能够改善高糖和TGFβ1诱导的足细胞损伤,上调足细胞表面特征性蛋白nephrin、podocin和α3p1整合素的表达,下调p-Akt蛋白的过度表达,提示BBR缓解足细胞损伤发挥肾脏保护作用可能与PI3K/Akt通路有关。