研究背景同种异体复合组织移植(Composite Tissue Allotransplantation,CTA)是各种严重创伤、先天畸形、肿瘤切除等造成大面积组织缺损及功能障碍重要的、甚至唯一有效的治疗手段。尽管其对于形态和功能的修复效果良好,但移植患者需要长期甚至终身服用免疫抑制剂,且在经受急、慢性排斥反应时需要应用大剂量的激素和免疫抑制剂冲击治疗,给患者带来了严重的毒副作用。因此,如何诱导免疫耐受是当前迫切需要解决的问题。巨噬细胞不仅作为天然免疫反应的重要成员直接参与移植排斥反应,还扮演抗原提呈细胞(Antigen Presenting cells,APCs)的角色辅助T细胞间接参与移植免疫。根据表型及功能的不同,巨噬细胞可分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可分泌IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ等一系列促炎因子,促进移植排斥的发生,而M2型巨噬细胞可分泌IL-10、TGF-β等抑炎因子及诱导Treg的产生,参与免疫耐受的诱导。大量的研究表明,CD226和TIGIT是表达于T细胞、NK细胞表面的共刺激/抑制分子,可竞争性结合APCs表面的CD155分子,从而分别活化和抑制T细胞、NK细胞。然而,目前的研究均集中在CD226/TIGIT-CD155信号对于T细胞、NK细胞等效应细胞功能的影响,少有研究其对于APCs功能的影响。有研究表明,TIGIT可通过作用于树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)表面的CD155分子,从而促进DCs IL-10的分泌和抑制IL-12的分泌,间接抑制CD4~+T细胞的活化与增殖。巨噬细胞作为一种APCs同样表达有CD155分子,CD226和TIGIT分别作用于巨噬细胞的CD155分子后,是否对于CD155下游信号通路产生不同作用,从而调控巨噬细胞的极化,参与移植免疫有待研究。因此,通过干预CD226/TIGIT-CD155信号研究其对于巨噬细胞极化的调控效应及机制,从而探索诱导移植免疫耐受的方案值得我们研究。研究目的研究干预CD226/TIGIT-CD155信号通路对巨噬细胞极化的调控效应及机制,探索诱导同种异体移植免疫耐受的方案。研究方法首先我们建立巨噬细胞与淋巴细胞共培养体系,即以1:5的比例共培养腹腔巨噬细胞与脾脏淋巴细胞的同时,加入LPS和α-CD3 mAb。观察共培养前后巨噬细胞的CD155表达变化和CD4~+T细胞的CD226、TIGIT表达变化。然后在共培养体系中加入α-CD226 mAb或α-TIGIT mAb,分别阻断CD226-CD155信号和TIGIT-CD155信号。观察干预CD226/TIGIT-CD155信号对于共培养体系中巨噬细胞极化的影响及CD4~+T细胞增殖、分化的影响。从mRNA水平和蛋白水平对巨噬细胞的极化进行检测:qPCR法检测巨噬细胞中M1型相关基因IL-12p40、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、IFN-γ、MCP-1和M2型相关基因Arg1、FIZZ1、YM1、IL-10的表达水平变化;流式细胞术标记M1型巨噬细胞的标志物CD11c和M2型巨噬细胞标志物CD206,分析CD11c~+CD206~-的M1型细胞和CD11c~-CD206~+的M2型细胞的比例变化。通过基于流式细胞术的CFSE染色法检测CD4~+T细胞的增殖,qPCR法检测Th1、Th2、Th17和Treg的转录因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3的mRNA表达水平差异。同时,通过流式细胞术检测Treg的比例变化。由于巨噬细胞和淋巴细胞共培养体系成分较复杂,且多种配受体参与相互作用。为了孤立研究CD226和TIGIT对于巨噬细胞CD155的作用,我们分别用CD226-Fc和TIGIT-Fc代替T细胞提供的CD226和TIGIT信号,刺激巨噬细胞的CD155分子。巨噬细胞实验分组为:Resting组(无任何刺激)、Ctrl组(LPS刺激)、CD226-Fc组(LPS+CD226-Fc刺激)、TIGIT-Fc组(LPS+TIGIT-Fc)。同样通过qPCR法和流式细胞术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD226-Fc和TIGIT-Fc对于巨噬细胞极化的影响。同时,对细胞培养上清进行LUMINEX多因子检测,观察IL-10、TNF-α、IL-12p70、MCP-1、IL-1β、IL-6、IFN-γ的水平变化。将巨噬细胞用CD226-Fc或TIGIT-Fc预处理后与淋巴细胞共培养,观察融合蛋白预处理的巨噬细胞对于CD4~+T细胞增殖和分化的影响。最后,我们通过Western Blot检测CD226-Fc和TIGIT-Fc对于巨噬细胞极化和IL-10分泌相关信号通路SHP-1-ERK1/2-MSK1-CREB磷酸化水平的影响,同时通过细胞免疫荧光和分离胞浆、胞核蛋白进行Western Blot检测IL-10转录因子CREB的核转位变化。体内实验部分,我们建立了以Balb/c小鼠(H-2~d)为供体,C57BL/6小鼠(H-2~b)为受体的同种异体皮瓣游离移植模型。将受体小鼠分为三组:分别为WT组、CD226KO组(受体鼠敲除CD226分子)、WT+TIGIT-Fc组。各组小鼠均于术后1周内每天腹腔注射3mg/kg的雷帕霉素(Rapamycin,Rapa),术后第2周至第4周则每隔一天注射3mg/kg。WT+TIGIT-Fc组小鼠在手术当天及术后7天分别内眦静脉注射100μg的TIGIT-Fc,而WT组或CD226KO组则注射100μg的对照抗体。观察CD226KO或TIGIT-Fc给药对于移植皮瓣存活时间的影响,并在术后4周、6周、8周取移植皮瓣进行HE染色,观察其病理学变化。同时,在术后4周取各组移植小鼠脾脏和淋巴结,通过流式细胞术观察CD226KO或TIGIT-Fc给药对于巨噬细胞极化和Treg比例的影响。最后,以各组移植小鼠淋巴结细胞为反应细胞,以经过丝裂霉素C处理的不同品系小鼠来源的脾脏淋巴细胞为刺激细胞进行单向混合淋巴细胞反应,检测各组移植小鼠CD3~+T细胞对于自体抗原、供体特异性抗原和第三方抗原反应性的差异。研究结果在巨噬细胞与淋巴细胞共培养体系中,经过共培养活化后的巨噬细胞CD155表达水平显著增高,同时共培养活化后的CD4~+T细胞的CD226和TIGIT的表达水平也均显著增高。共培养体系中加入α-CD226 mAb阻断CD226-CD155信号可显著促进巨噬细胞M2型相关基因Arg1、FIZZ1、IL-10的表达,而抑制M1型相关基因iNOS、IL-1β、IL-12p40的表达;加入α-TIGIT mAb阻断TIGIT-CD155信号则抑制巨噬细胞M2型相关基因IL-10的表达,促进M1型相关基因iNOS、IL-1β、TNF-α的表达。同时,流式细胞术检测结果发现,加入α-CD226 mAb可显著促进巨噬细胞向M2型极化,抑制其向M1型极化。而加入α-TIGIT mAb则起到相反的调控作用。α-CD226 mAb可抑制共培养体系中CD4~+T细胞的增殖和提高Treg的比例,抑制Th1和Th17转录因子T-bet、RORγt的表达,促进Treg转录因子Foxp3的表达。而α-TIGIT mAb对于CD4~+T细胞的增殖和分化则起相反的调控作用。qPCR结果和流式细胞术、LUMINEX结果分别从mRNA水平和蛋白水平表明,TIGIT-Fc可促进M2型相关基因的表达,而抑制M1型相关基因的表达。CD226-Fc则起到与TIGIT-Fc相反的调控作用。TIGIT-Fc可抑制巨噬细胞内SHP-1磷酸化,促进ERK1/2-MSK1-CREB信号通路的磷酸化,最终促进IL-10的转录因子CREB的核转位。而CD226-Fc则起到相反的调控作用。TIGIT-Fc预处理的巨噬细胞可抑制CD4~+T细胞的增殖及向Th1、Th17分化,促进向Treg分化,而CD226-Fc预处理的巨噬细胞可促进CD4~+T细胞向Th1分化。同种异体皮瓣移植模型中,CD226KO或TIGIT-Fc给药均能够显著延长移植物存活时间,提高脾脏和淋巴结中Treg的比例,降低M1型巨噬细胞比例、增加M2型比例。受体CD3~+T细胞在供体抗原的刺激下增殖比例显著下降,而对第三方抗原的反应性无显著差异,提示该效应具有抗原特异性。血清中促炎因子IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17A水平显著降低,抑炎因子IL-10水平显著增高。研究结论CD226、TIGIT竞争性结合巨噬细胞表面CD155,对于其下游信号通路起到相反的调控作用。TIGIT-CD155信号通过ERK1/2-MSK1/CREB途径增加IL10转录,促进巨噬细胞向M2型极化。体内阻断CD226信号或增强TIGIT信号可通过促进M2型巨噬细胞极化及Treg的扩增、上调血清IL-10水平和下调促炎因子水平从而抑制排斥反应,促进移植免疫耐受的诱导。因此,CD226/TIGIT-CD155信号可作为调控移植排斥反应的关键靶点。