自上世纪七十年代以来，我国恶性肿瘤的发生率和死亡呈明显上升趋势，成为威胁公共健康的主要问题。据2005年的统计资料显示，作为一种常见消化道肿瘤，胃癌的发病率及死亡率分为54.5／10万、42.1／10万，均居各类肿瘤的第三位。目前胃癌的治疗以多种方式联合的综合治疗为主，但以胃癌发病率和死亡率数值之接近来看，胃癌的治疗效果不容乐观。所以寻找新型抗肿瘤药物成为各种基础和临床研究的重点。传统中药有着悠久的抗肿瘤治疗历史。作为中国的特色资源，发掘其抗肿瘤治疗的新靶点有着重要的研究意义。苦参碱（Matrine）属喹诺里西啶类，是中药苦参含量最高的生物碱成分之一。众多研究表明，苦参碱具有体内及体外抗肿瘤作用。苦参碱可以抑制人肝癌细胞系SMMC-7721、人胃腺癌细胞系MKN45、SGC7901的增殖，进一步实验提示苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡与上调Bcl-2家族的促凋亡因子和上调细胞周期蛋白E2F-1的表达相关。同时在对白血病细胞系研究中发现，苦参碱可以抑制K562细胞的增殖并诱导其分化，此外苦参碱对多药耐药细胞株K562／vin，K562／dox也具有诱导凋亡作用。在动物试验中，苦参碱显示了与化疗药物5-Fu的协同作用。苦参碱的抗肿瘤活性还与抑制环氧化酶-2及特异性诱导拓扑异构酶Ⅰ表达相关。以上研究从不同角度对苦参碱抗肿瘤机制进行探讨，但很少涉及苦参碱发挥其抗肿瘤作用时对蛋白质翻译的影响及相关细胞信号传导通路改变。翻译是遗传信息传递的最后一步，可分为起始，延伸和终止三个阶段。而起始是翻译过程中的限速步骤，也是最常见的翻译调控目标。真核细胞翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）在这种调控机制中发挥重要作用，其数量、活性及完整性是主要的调控对象。翻译起始中的主要事件是翻译起始复合物eIF4F的形成。eIF4F结合mRNA 5’端帽子结构，由eIF4E、eIF4A和eIF4G三个部分组成。eIF4E是帽子结合蛋白，与脚手架蛋白eIF4G相互作用，后者结合在具有RNA解旋酶功能的eIF4A上。由于eIF4E能够识别5’端的7-甲基鸟苷三磷酸，是帽子依赖的翻译起始过程中最重要的一步，因此受到各种研究的重视。据报道影响eIF4E的信号传导通路主要有2条，Akt／mTOR （themammalian target of rapamycin）及MAPK（mitogen-activated protein kinase）途径。受到广泛关注的雷帕霉素（Rapamicin）即能特异性抑制mTOR途径影响翻译。此外eIF4E结合蛋白（eIF4E-binding proteins，4E-BPs）能通过竞争性结合eIF4E而抑制翻译起始复合物eIF4F的形成。当4E-BPs去磷酸化时，它能与eIF4G竞争性结合eIF4E，使其处于无功能状态。当4E-BPs重新磷酸化时，它与eIF4E解离，激活翻译。哺乳动物细胞的蛋白质合成易受各种促进生长、抑制生长因子及压力环境的影响。异常的翻译调控可以导致细胞的恶性转化以及翻译起始因子和信号传导通路的改变。目前认为在这些翻译调控相关因素的改变是造成蛋白异常表达的重要原因。翻译起始过程中最关键的因子eIF4E与恶性肿瘤发生发展的关系日益引起人们的关注。研究发现eIF4E不仅可以从全局调节翻译速度，还可以增强一些促进细胞生长、凋亡相关蛋白的翻译，如癌基因编码的蛋白和生长因子。体内实验表明，eIF4E过度表达能促进细胞增殖，并可以诱导恶性转化和肿瘤发生。众多研究证实eIF4E在正常情况下低水平表达，而在多种恶性肿瘤（头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌等）组织和肿瘤旁组织中elF4E过度表达，并与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关。因此eIF4E被认为是一种癌基因。Ras是一种小GTP结合蛋白，它是Raf／MEK／ERK、PI3K／Akt等众多信号传导通路的常见上游调控分子，导致Raf／MEK／ERK、PI3K／Akt的级联反应。ras基因突变是肿瘤发生过程中的早期事件。ras基因突变在肿瘤中是广泛存存的。据报道大约30％的肿瘤检测到ras基因突变，胃癌中的ras突变也有较多报道，其突变率在2.8-18.5％之间。研究表明ras基因突变可以引起Ras蛋白持续性的活化，最终导致细胞不受控制的增殖。研究认为Ras参与了elF4E诱导的恶性转化，Ras介导的细胞生存必须依靠elF4E依赖的蛋白合成。在前期研究中，应用Affymetrix基因芯片技术检测了苦参碱作用后HT29细胞基因表达谱的改变，发现多种真核细胞翻译起始因子（eIFs）及ras家族、MAPK家族的mRNA表达发生了上调。而这几类基因的功能都与eIF4E的调控相关。这为后续研究提供了线索。我们推测影响翻译起始是苦参碱抑制肿瘤细胞增殖的可能机制之一。但基因芯片上并不能反映eIF4E功能状态的改变，也不能提供相关蛋白或激酶活性的变化情况。因此我们设计了第一部分研究，以明确在翻译起始调控水平上苦参碱对胃癌细胞MKN45的增殖抑制机理，包括苦参碱对MKN45细胞的增殖抑制及各种eIFs的磷酸化水平变化。在第二部分研究中则着重研究翻译起始调控相关信号传导通路上的各类激酶、磷酸酶的作用。在第三部分研究中，我们研究了苦参碱对Ras异常活化的肿瘤细胞的抑制作用，并构建了质粒Ras-pcDNA3.1（-）转染胃癌细胞AGS。第一部分苦参碱可通过调节翻译起始因子eIF4E和4E-BP1抑制胃癌细胞MKN45的增殖本实验发现不同浓度苦参碱（0.05，0.10，0.25，0.50，1.0mg/ml）对胃癌细胞MKN45有增殖抑制作用，并呈浓度依赖性和时间依赖性。MKN45细胞经苦参碱处理48h，其IC₅₀值为0.53mg/ml。流式细胞仪检测发现苦参碱诱导细胞凋亡呈浓度依赖性，0.50mg/ml时达到最高凋亡率26.88％。在0至0.25mg/ml浓度范围内，MKN45细胞的G0／G1期比例有升高，可能存在G0／G1期阻滞。研究还发现MKN45细胞经不同浓度的苦参碱作用48小时后，eIF4E的磷酸化水平明显下降，并存在量效关系和时间依赖性。eIF4E的结合蛋白4E-BP1也出现了类似的结果，即磷酸化水平呈浓度和时间依赖性下降，不同的是，经苦参碱作用后，4E-BP1的表达总量也有升高。由于eIF2磷酸化的α亚单位能够稳定eIF2-GDP-eIF2B复合物，为此还检测了eIF2α的活性，结果未发现eIF2磷酸化水平的改变。提示苦参碱可能通过减弱eIF4E和4E-BP1的磷酸化水平，影响MKN45细胞的翻译起始过程。第二部分苦参碱可通过减弱Erk1／2活性抑制MKN45细胞的翻译起始Akt/mTOR及MAPK途径是调控4E-BP1和eIF4E活性的主要两条信号传导通路。本研究发现各浓度的苦参碱均可以抑制Erk1／2 MAPK的活性，且与4E-BP1和eIF4E磷酸化水平相对一致，结果表明苦参碱可通过抑制Erk1／2MAPK减弱4E-BP1和eIF4E的磷酸化；而苦参碱对p38MAPK的活性无明显影响，JNK、Akt、mTOR的活性（磷酸化水平）改变与4E-BP1和eIF4E表现不一致，提示相互无关。研究还发现抑制PP2A活性使苦参碱处理组细胞及对照组细胞的4E-BP1磷酸化水平明显下降，推测PP2A可能参与此过程。第三部分Ras异常表达的胃癌细胞AGS的建立及苦参碱对其的增殖影响的研究Ras活化在胃肠道肿瘤的发生演变中具有重要作用，目前缺乏能应用于临床的Ras特异性抑制剂。为研究苦参碱对Ras异常活化的肿瘤细胞抑制作用，实验运用RT-PCR技术克隆H-Ras序列（571bp，BC095471），构建重组真核表达质粒H-Ras-pcDNA3.1（-）。因MKN45细胞的转染效率低下，所以选择AGS细胞进行转染，建立H-Ras-pcDNA3.1（-）-AGS（简称R-AGS）和pcDNA3.1（-）-AGS（简称p-AGS）。经Western blot法鉴定，与p-AGS及AGS相比，R-AGS高表达H-Ras。用MTT法测定不同浓度苦参碱对AGS、p-AGS、及R-AGS的增殖抑制率，发现AGS、p-AGS、R-AGS细胞的增殖均受到了明显的抑制，并呈剂量依赖性（ANOVA，P均小于0.001）。软琼脂克隆形成实验表明，三种细胞之间的克隆密度均存在显著性差异（Univariate，P均小于0.001），R-AGS组与p-AGS组、AGS组比较，具有更高的克隆形成率，R-AGS组克隆密度高，而克隆体积较小；p-AGS组克隆密度低，但是克隆体积较大；AGS组的克隆密度居两者之间，而体积与R-AGS相似。经克隆计数发现，仅在0.5mg／ml苦参碱处理时，R-AGS克隆形成数与其余4个浓度相比均存在显著性差异（Dunnett t test，p均低于0.001），但在p-AGS组、AGS组也观察到类似的现象（Dunnett t test，p均低于0.001），同时发现苦参碱对三种细胞的克隆形成抑制率没有显著性差异（ANOVA，p＞0.05），均提示Ras不是苦参碱的作用靶点。苦参碱在较高的浓度时对Ras异常表达的胃癌细胞AGS生长有一定的抑制作用，但与p-AGS、AGS细胞相比，苦参碱并没有表现出对R-AGS的克隆形成具有更高的抑制能力，提示苦参碱的非Ras依赖作用。结论1．证明苦参碱抑制胃癌细胞系MKN45翻译起始因子eIF4E和抑制蛋白4E-BP的磷酸化水平，呈剂量和时间依赖性，提示eIF4E和4E-BP可能是苦参碱抗肿瘤作用的新靶点。2．发现苦参碱可减弱Erk1／2 MAPK活性，并与eIF4E和4E-BP的磷酸化水平改变相对一致，表明苦参碱可通过抑制Erk1／2MAPK减弱4E-BP1和eIF4E的磷酸化；苦参碱不是通过p38、JNK、Akt／mTOR通路调控翻译起始。3．证明Ras不是苦参碱的明确作用靶点。