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研究背景和目的多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）系发源于浆细胞的血液肿瘤,好发于老年人,近年来发病率逐渐升高,该病症状隐匿、早期诊断困难,临床症状复杂多变,多以病理性骨折、肾功能损害、髓外浆细胞瘤压迫神经等严重并发症就诊,给患者带来极大的痛苦。传统以化疗及干细胞移植为主要治疗手段;随着对于MM分子机制的认识深入,蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体等组成该病治疗的全新模式。但是,MM目前依然无法治愈,耐药和复发成为主要挑战,复发患者治疗手段有限,并发症多种多样,生活质量下降,带来极大的经济及心理负担。该病中医治疗参照“骨痹”,“水肿”等治疗,新药时代中西结合治疗模式以辨病结合辨证为主,挖掘临床应用有效的天然药物展开机制研究,促进基础研究及临床应用的转化是中医药治疗疑难重症的优势及使命。雷公藤是治疗痹症的传统药物,有丰富的临床应用基础,它是卫矛科一年生藤本植物,广泛用于骨痛、类风湿、肾病等治疗。雷公藤的现代研究揭示在调节免疫的同时具有抗肿瘤活性。多发性骨髓瘤以骨痛为主要表现,因此,基于辨病及辨证相结合的中西结合诊疗模式,导师课题组在验方基础上常加用雷公藤,可有效改善患者临床症状。课题组在此基础上深入开展雷公藤功效成分抗骨髓瘤的机制研究,证实其活性成分雷公藤红素具有调控TLR-NF-κB信号通路、体外诱导骨髓瘤细胞凋亡的作用。目前对于雷公藤红素抗肿瘤活性的研究证实其具有调控细胞增殖、生存、凋亡等信号通路的作用。白细胞介素-1受体相关激酶（IRAK）作为炎癌通路的关键通路,其抗肿瘤作用、化疗增敏及克服耐药等方面引起了普遍关注,也作为抗肿瘤药物开发的潜在靶点,为了进一步深入研究雷公藤红素对于MM的作用机制,在临床应用基础上开发潜在靶点药物、促进临床及基础研究的相互转化,形成中西结合治疗MM优效新方案,本研究在前期导师课题组工作基础上,通过网络药理及分子对接分析雷公藤红素抗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点;在此基础上,进一步深入研究雷公藤红素对MM细胞株H929、ARP-1增殖、凋亡及IRAK4/MAPK信号通路的影响;并通过雷公藤红素、硼替佐米以及二者联合对于MM细胞株增殖、凋亡、IRAK4/MAPK信号通路的影响探索雷公藤红素是否可以增加MM对于硼替佐米的敏感性。研究方法网络药理及分子对接研究方法:1.在中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）,筛选雷公藤红素的作用靶点基因,输入Uniprot数据库进行基因标准化处理;2.在治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database,TTD）、DrugBank 数据库、药物遗传学和药物基因组学知识库（Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base,PharmGKB）、人类孟德尔遗传病的数据库（Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM）、人类基因综合数据库（Gene Cards）中输入“multiple myeloma”筛选疾病靶点基因,去重后获得MM的靶点基因;3.将雷公藤红素潜在靶基因与MM靶点基因用韦恩图在线工具进行交集,获得雷公藤红素抗MM的潜在靶点基因。4.在 STRING 数据库中（search tool for recurring instances of neighbouring genes,STRING）,输入雷公藤红素抗MM的靶点,物种设置为“Homo sapiens”,利用Cytoscape软件,构建雷公藤红素和MM靶蛋白一蛋白的网络关系,筛选雷公藤红素抗MM的潜在核心靶点。5.对潜在靶点进行基因本体（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析,删除非通路条目后,对GO和KEGG分析结果进行可视化处理。6.通过Schordinger软件Glide模块对雷公藤红素与蛋白的进行分子对接,并采用pymol进行图片处理。实验研究方法:1.对H929、ARP-1细胞进行药物干预24h和48h,利用CCK-8实验方法检测各组细胞活性和增殖抑制率;并计算这两株细胞的半数抑制浓度（IC50）。2.对H929、ARP-1细胞进行药物干预24h,Annexin V/PI双染流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）分析H929、ARP-1细胞的凋亡情况;3.对H929、ARP-1细胞进行药物干预24h,免疫印迹实验（Western Blot,WB）用于检测各组细胞IRAK4/MAPK信号通路相关蛋白、凋亡蛋白PARP、Cleaved caspase3、耐药蛋白MDR1、LRP1、BCRP的表达情况;研究结果网络药理及分子对接研究结果:1.在TCMSP数据库中收集雷公藤红素25个作用靶点,在TTD、DrugBank、PharmGKB、OMIM、Gene Cards分别检索MM的基因靶点,删除重复后检索到3932个MM的靶点基因。韦恩分析结果示雷公藤红素有23个抗MM的靶点基因。2.根据STRING数据库筛选结果提示,雷公藤抗MM的核心靶蛋白主要有:JUN、BCL2、BAX、MYC、VEGFA 等等。3.GO和KEGG通路富集分析结果表明,雷公藤红素具有抗MM的作用,可能与P53、IL-17、TNF、MAPK、JAK-STAT、NF-KB、PI3K-Akt、凋亡等信号通路有关。4.分子对接结果显示,雷公藤红素与ERK、P65、P53、STAT3的结合作用较强。实验研究结果:1.CCK-8实验结果显示,雷公藤红素（cel）呈时间-浓度依赖性抑制H929、ARP-1细胞的增殖。Cel对H929细胞株在24h、48h的IC50值分别为（2.502±0.204）和（1.760±0.167）μmol/L,对 ARP-1 细胞株 IC50 值分别为（0.956±0.105）和（0.612±0.014）μmol/L;在 H929、ARP-1细胞中,与空白对照、Cel、硼替佐米（Bortezomib,BTZ）单用相比,Cel联合BTZ用药组的细胞增殖抑制效果更强,利用金氏公式（判断联合用药后的最终效应）求得Q值为分别为（1.877±0.127）、（1.161±0.068）。2.Annexin V/PI的染色结果显示,随着Cel的浓度逐渐升高,ARP-1细胞凋亡率分别为（3.26±0.27）%、（20.57±0.35）%、（33.26±0.51）%和（77.45±0.78）%,H929 细胞凋亡率分别为（1.24±0.33）%、（7.76±1.87）%、（27.33±4.09）%和（85.79±0.86）%;在 H929、ARP-1细胞中,与空白对照、Cel、BTZ单用相比,Cel联合BTZ用药组的细胞凋亡率最高,分别为（80.49±1.01）%和（85.79±0.86）%。3.WB检测结果提示,在H929、ARP-1细胞中,随着Cel浓度的升高,p-IRAK4、p-ERK、p-p38、VEGF和耐药蛋白MDR1、LRP1、BCRP逐渐低表达,凋亡蛋白PARP、Cleaved caspase3明显高表达;与空白对照、Cel、BTZ单用相比,Cel联合BTZ用药组中,p-IRAK4、p-ERK、p-p38、VEGF 和耐药蛋白 MDR1、LRP1、BCRP 表达最低,凋亡蛋白 PARP、Cleaved caspase3表达水平最高。研究结论1.根据网络药理及分子对接分析,可知雷公藤红素具有抗MM的作用,其机制可能与诱导凋亡、调控P53、MAPK、JAK-STAT、NF-KB等相关的信号通路有关。2.雷公藤红素可以抑制MM细胞增殖,诱导MM细胞凋亡,其分子机制可能与阻断IRAK4/MAPK信号通路激活有关。3.雷公藤红素联合硼替佐米具有协同性,能够增强MM细胞对硼替佐米的敏感性。