研究背景心肌梗死可由持续性心血管供血不足所导致的心肌缺氧和凋亡所引发。M3受体（Muscarinic Acetylcholine 3 Receptor,M3）与心肌缺氧和凋亡的联系紧密。已有的心肌细胞凋亡研究显示,4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶甲碘化物（4-diphenylacetoxy-Nmethylpiperidine methiodide,4-DAMP）等M3受体抑制剂能够加重心肌缺氧后的损伤作用,诱导心肌细胞凋亡。相反,乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）可以激动M3受体逆转并有助于保护心肌免受缺氧损伤,降低哺乳动物心肌缺血面积,延缓心肌细胞凋亡进程,改善心肌细胞凋亡。然而,M3受体介导的心肌缺氧是如何引起心肌细胞凋亡的作用机制还尚未明确。因此,深入开展M3受体介导的心肌细胞缺氧后的凋亡机制研究,可进一步明确其受体功能,从而作为潜在的药物保护作用靶点,为保护心肌细胞凋亡引发的心肌梗死预防提供新思路。长链非编码RNA心肌梗死相关转录物（Myocardial Infarction Associated Transcript,MIAT）作为心肌梗死的生物标记物,已被认为同时与心肌缺氧和心肌细胞凋亡的发生密切相关。近来文献报道,Lnc MIAT能够与mi RNA相互结合,共同参与调控心血管疾病的发病机制。通过生物信息学的序列比对分析,mi R-708-5p可与Lnc MIAT相互作用,并且与心肌细胞凋亡过程的重要蛋白p53的m RNA表达相关。借助生物学信息关系研究和分析,我们发现Lnc MIAT和mi R-708-5p,mi R-708-5p和p53 m RNA可能通过结合位点相互作用。故阐明Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53在缺氧引起心肌细胞凋亡的机制,对深入揭示M3受体介导心肌缺氧后细胞凋亡的作用,探寻针对缺氧后心肌细胞凋亡的预防和治疗靶点具有重要的意义。黄芪甲苷（Astragaloside IV,AS-IV）作为黄芪的主要有效成分,具有较为明确的心肌保护,抑制心肌缺血后心肌细胞凋亡的作用。课题组前期研究结果显示,经典名方当归补血汤（黄芪:当归=5:1）对大鼠心肌缺血及凋亡现象均具有良好的保护作用。为深入研究AS-IV的心肌保护作用机制,我们通过CB-Dock（Cavity-Detection Guided Blind Docking,CB-Dock）对AS-IV与M3受体的小分子蛋白相互作用进行分析得出,AS-IV与M3受体存在7个高可能性的互作药用靶点。然而,AS-IV能否通过激动M3受体保护心肌细胞缺氧,并通过Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴调控心肌细胞凋亡的作用尚不清楚。本次研究中,我们首先通过复制小鼠心肌缺血模型的体内研究,观察AS-IV调控M3受体对心肌缺氧与凋亡的抑制作用,并分析心肌缺氧损伤与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53 m RNA的相关性;随后,通过建立体外HL-1心肌细胞缺氧模型,运用FISH荧光共定位、双荧光酶素基因报告、RNA沉默与过表达等技术,以此阐明Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴在M3受体调控心肌细胞缺氧与凋亡的机制;最后,在HL-1心肌细胞下观察AS-IV激动M3受体对心肌缺氧与凋亡的抑制作用,mi R-708-5p过表达转染下同时给予AS-IV与4-DAMP,验证AS-IV是否通过M3受体影响Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴对HL-1细胞缺氧与凋亡作用。第一部分黄芪甲苷通过M3受体对MI小鼠缺氧后心肌损伤的保护作用目的:1.利用MI小鼠模型观察AS-IV通过M3受体对心肌缺血后心功能与心肌损伤的影响及其对心肌缺氧后凋亡的作用。2.RT-qPCR检测小鼠心肌组织中LncMIAT、mi R-708-5p和p53的表达变化,分析AS-IV激动M3受体保护小鼠心肌损伤和抑制心肌细胞凋亡与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的相关性。方法:依照文献和预实验结果选择给药浓度,将所有小鼠分为6组（每组6只）:（1）正常组;（2）MI组;（3）4-DAMP（0.4μg/kg/d,ip）组;（4）ACh（5mg/kg/d,ip）组;（5）4-DAMP+AS-IV（112mg/kg/d,ig）组;（6）AS-IV组。预先给药2周后,除正常组外,均采用左冠状动脉前降支结扎术（LAD）法进行手术,复制小鼠心肌缺血模型。并进行以下实验:1.观察AS-IV通过M3受体对MI小鼠心电图和心功能影响心电图检测各组小鼠ST段的抬高水平以及心率的变化情况。心脏超声检测各组小鼠心功能变化,包括左心室射血分数,短轴缩短率,左心室收缩末期直径和左心室舒张末期直径。2.观察AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌缺血面积、病理学和心肌损伤的影响TTC和H＆E染色法检测AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌缺血面积的变化和病理学改变。生化和ELISA法检测AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌损伤指标CK-MB、c Tn I和LDH的变化。3.观察AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌缺氧和细胞凋亡的影响Western-Blot观察AS-IV通过M3受体对MI小鼠缺氧指标HIF-1α和M3受体蛋白表达影响。Tunel（DAB）法检测AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌组织凋亡率的变化。免疫荧光法检测各组小鼠心肌细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达变化。4.预测AS-IV与M3受体结合靶点并分析AS-IV通过M3受体对MI小鼠的Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的变化情况及心肌损伤相关性利用CB-Dock分析AS-IV与M3受体可能的分子与蛋白结合靶点。RT-qPCR检测AS-IV通过M3受体对MI小鼠心肌组织中Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的表达变化,Western-Blot检测p53蛋白变化。建立Lnc MIAT、mi R-708-5p与心肌损伤指标CK-MB、c Tn I和LDH的相关性分析,并对Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53之间进行线性回归分析。结果:1.AS-IV激动M3受体对MI小鼠心电图和心功能影响AS-IV能够通过激动M3受体显著抑制了4-DAMP对MI小鼠ST段的抬高和心率的升高作用,并且显著改善了4-DAMP对小鼠左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）的降低作用和对心梗小鼠左心室舒张末期内径（LVIDd）和收缩期内径（LVIDs）的升高作用。结果提示AS-IV能够激动M3受体对MI小鼠心肌缺血和心功能损伤具有保护作用。2.AS-IV激动M3受体对MI小鼠心肌缺血面积、病理学和心肌损伤的影响AS-IV能够通过激动M3受体显著抑制4-DAMP对MI小鼠的心肌缺血面积的增加作用,并改善了4-DAMP对炎性细胞浸润以及心肌细胞核收缩或消失等病理损伤。心肌损伤方面,AS-IV能够通过激动M3受体显著降低4-DAMP对MI小鼠心肌损伤指标CK-MB、c Tn I和LDH的升高作用。研究结果提示AS-IV能够通过激动M3受体发挥保护MI小鼠心肌缺血损伤的作用。3.AS-IV激动M3受体对MI小鼠心肌缺氧和细胞凋亡的影响AS-IV能够激动M3受体显著改善4-DAMP对心肌缺氧指标HIF-1α的升高作用和M3蛋白表达的降低作用。Tunel（DAB）结果显示,AS-IV能够通过激动M3受体显著改善4-DAMP对MI小鼠心肌细胞凋亡率的升高作用。免疫荧光结果显示,AS-IV能够通过激动M3受体显著降低4-DAMP对MI小鼠心肌组织中凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达的升高,和Bcl-2的表达的降低作用。提示AS-IV能够通过激动M3受体保护MI小鼠心肌缺氧和抑制细胞凋亡。4.AS-IV激动M3受体对MI小鼠的Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的变化情况及心肌损伤相关性分析结果CB-Dock分析结果验证了AS-IV与M3受体存在7个可能的药用分子结合靶点。AS-IV能够通过激动M3受体显著降低4-DAMP对MI小鼠Lnc MIAT和p53表达的升高和mi R-708-5p表达的降低作用。相关性分析结果表明,Lnc MIAT的相对表达量与CK-MB、c Tn I及LDH成线性正相关;mi R-708-5p的相对表达量与CK-MB、c Tn I及LDH成线性负相关;p53 m RNA的相对表达量与CK-MB、c Tn I及LDH成线性正相关,且Lnc MIAT与mi R-708-5p,mi R-708-5p与p53的m RNA成一元线性回归。提示AS-IV激动M3受体抑制小鼠心肌细胞凋亡与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的调控密切相关。小结:1.AS-IV通过激动M3受体保护了小鼠心肌缺氧后的心功能与心肌损伤。2.AS-IV通过激动M3受体对MI小鼠心肌缺氧的保护作用与抑制小鼠心肌细胞凋亡作用相关。3.AS-IV激动M3受体抑制小鼠心肌细胞凋亡的作用与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的变化密切相关。第二部分Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴与M3受体调控心肌细胞缺氧与凋亡的机制目的:1.验证M3受体参与调控HL-1心肌细胞的缺氧程度和细胞凋亡作用。2.阐释Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴在M3受体调控心肌细胞缺氧后凋亡的作用机制。方法:复制HL-1心肌细胞缺氧24h模型,并对模型进行评估。随后,通过给予M3受体抑制剂4-DAMP和激动剂ACh加以预先干预,建立实验分组为:正常组、缺氧模型组、4-DAMP（10μM）组、ACh（10μM）组。除正常组外,其他实验组均在HL-1心肌细胞缺氧24h的模型下进行。分别进行以下实验:1.观察M3受体对HL-1心肌细胞缺氧与凋亡的调控及LncMIAT、miR-708-5p和p53的表达影响Western-Blot观察M3受体干预下对缺氧指标HIF-1α的蛋白表达变化影响。通过GEO数据库分析,获得Lnc MIAT的表达与心肌缺血和缺氧相关性。RT-q PCR观察Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53 m RNA的变化情况。运用KEGG通路分析,探索心肌缺氧的损伤与凋亡通路之间的联系。流式细胞术观察缺氧后HL-1心肌细胞凋亡率的变化。Western-Blot检测缺氧下相关凋亡指标Bax、Bcl-2、Caspsae-3和p53的蛋白表达变化。2.Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴的生物信息学分析与实验验证运用FISH荧光共定位,生物信息学序列比对,预测Lnc MIAT与mi R-708-5p,mi R-708-5p与p53 m RNA相互作用的可能性。在HEK293T细胞中转染构建的野生型和突变型Lnc MIAT与p53 m RNA的序列,双荧光酶素基因报告实验验证Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴的关系。分别应用Si-Lnc MIAT,mi R-708-5p过表达和低表达转染处理HL-1心肌细胞后,在HL-1心肌细胞缺氧24h模型下,流式细胞术观察各组HL-1心肌细胞的凋亡率变化,RT-q PCR检测各组Bax、Bcl-2、Caspsae-3和p53的m RNA表达变化,Western-Blot检测各组Bax、Bcl-2、Caspsae-3和p53的蛋白表达变化;应用Si-Lnc MIAT与mi R-708-5p低表达共转染,在HL-1心肌细胞缺氧24h模型下,流式细胞术观察各组HL-1心肌细胞的凋亡率变化,RT-q PCR检测各组Bax、Bcl-2、Caspsae-3和p53的m RNA表达变化,Western-Blot检测各组Bax、Bcl-2、Caspsae-3和p53的蛋白表达变化。结果:1.M3受体可调控HL-1心肌细胞缺氧程度,并与凋亡过程及Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的表达变化密切相关Western-Blot结果表明,抑制剂M3受体能够显著增加心肌细胞缺氧指标HIF-1α表达。经GEO数据集和KEGG通路分析与实验验证,心肌缺氧与细胞凋亡通路和Lnc MIAT的表达量变化密切相关。M3受体抑制剂4-DAMP能够显著增加心肌细胞凋亡率及Lnc MIAT和p53蛋白与m RNA的表达,降低mi R-708-5p的表达。结果提示抑制M3受体能够增加心肌细胞缺氧与凋亡,并与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的变化相关。2.Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴的预测分析与实验验证结果在HL-1细胞中,通过FISH荧光共定位显示Lnc MIAT与mi R-708-5p同在细胞质中表达,存在相互作用可能性。通过生物信息学序列比对,得到Lnc MIAT与mi R-708-5p,mi R-708-5p与p53 m RNA间存在结合位点。为验证结合位点,在HEK293T细胞中转染构建的野生型和突变型的Lnc MIAT与p53 m RNA,通过双荧光素酶基因报告实验测定各荧光素值,证明Lnc MIAT与mi R-708-5p,mi R-708-5p与p53 m RNA间有相互结合,提示存在Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53的轴性关系。3.体外HL-1分别转染Si-Lnc MIAT、mi R-708-5p过表达和低表达对缺氧心肌细胞凋亡和p53表达的影响体外HL-1转染Si-Lnc MIAT能够显著抑制缺氧心肌细胞的凋亡,并上调mi R-708-5p且下调p53的表达。提示转染Si-Lnc MIAT能够抑制HL-1心肌细胞缺氧后凋亡作用。体外HL-1转染mi R-708-5p过表达能够显著降低缺氧心肌细胞的凋亡率及Bax、Caspase-3和p53的m RNA与蛋白表达,并显著升高Bcl-2的表达。体外HL-1转染mi R-708-5p低表达能够显著升高缺氧心肌细胞的凋亡率及Bax、Caspase-3和p53的m RNA与蛋白表达,并显著降低Bcl-2的表达。提示mi R-708-5p过表达能够抑制缺氧心肌细胞凋亡作用,而mi R-708-5p低表达能够促进缺氧心肌细胞凋亡作用。4.体外HL-1共转染Si-Lnc MIAT与mi R-708-5p低表达对缺氧心肌细胞凋亡和p53表达的影响相比Si-Lnc MIAT或mi R-708-5p低表达单独转染,Si-Lnc MIAT+mi R-708-5p低表达共转染能够显著改变缺氧心肌细胞的凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3和p53的m RNA与蛋白表达。结果提示Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴能够参与调控心肌细胞凋亡作用。小结:1.M3受体参与调控HL-1心肌细胞的缺氧程度,抑制M3受体能够增加缺氧后心肌细胞的损伤和凋亡。2.Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴介导了M3受体对缺氧后心肌细胞凋亡的调控。第三部分黄芪甲苷通过M3受体影响Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴在HL-1细胞缺氧与凋亡中的保护作用目的:1.利用HL-1细胞缺氧模型,探究AS-IV通过M3受体对心肌细胞缺氧与损伤影响及心肌细胞凋亡的作用。2.阐明AS-IV激动M3受体通过Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴调控缺氧心肌细胞凋亡中的作用。方法:根据CCK-8实验结果筛选AS-IV的最佳给药时间和浓度。给药分组共为6组:正常组、缺氧模型组、4-DAMP（10μM）组、ACh（10μM）组、4-DAMP+AS-IV（100μg/ml）组和AS-IV（100μg/ml）,作用时间为24h。除正常组外,均使用上述构建的HL-1心肌细胞缺氧模型缺氧24h。并进行以下实验:1.观察AS-IV通过M3受体对小鼠心肌细胞缺氧损伤和M3受体蛋白表达的影响生化和ELISA法测量小鼠心肌细胞缺氧HL-1心肌细胞的损伤指标CK-MB、c Tn I和LDH的变化,Western-Blot观察小鼠心肌细胞缺氧指标HIF-1α和M3受体蛋白表达变化。2.观察AS-IV通过M3受体对小鼠心肌细胞缺氧后凋亡及Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53的影响在AS-IV与M3受体抑制剂下,流式细胞术观察小鼠心肌细胞缺氧后的凋亡率变化,Western-Blot观察心肌细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和p53的表达变化,RT-q PCR检测Bax、Bcl-2和Caspase-3的m RNA表达变化,并检测细胞中Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53 m RNA的表达变化。3.在AS-IV对给予M3受体抑制剂与mi R-708-5p mimic或mi R-708-5p inhibitor的HL-1细胞缺氧模型下,观察p53表达、细胞凋亡率和凋亡蛋白的影响在转染mi R-708-5p过表达并给予AS-IV与M3受体抑制剂下,流式细胞术观察心肌细胞的凋亡率变化,Western-Blot观察心肌细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和p53的表达变化,RT-q PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3和p53 m RNA的表达变化。在转染mi R-708-5p低表达并给予AS-IV与M3受体抑制剂下,流式细胞术观察各组心肌细胞的凋亡率变化,Western-Blot观察心肌细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和p53的表达变化,RT-q PCR检测Bax、Bcl-2和Caspase-3和p53 m RNA的表达变化。结果:1.AS-IV激动M3受体对小鼠心肌细胞缺氧损伤和M3受体蛋白表达的影响AS-IV能够通过激动M3受体显著减弱4-DAMP对心肌细胞损伤指标CK-MB、c Tn I、LDH含量和心肌缺氧指标HIF-1α的升高,及M3的蛋白表达的降低作用。结果提示AS-IV可通过激动M3受体改善小鼠心肌细胞缺氧后损伤,并升高M3受体蛋白的表达。2.AS-IV激动M3受体对小鼠心肌细胞缺氧后凋亡的保护作用及LncMIAT、mi R-708-5p和p53表达影响AS-IV能够通过激动M3受体显著降低4-DAMP对小鼠心肌细胞凋亡信号Bax、Caspase-3、p53表达和凋亡率的升高,以及Bcl-2的表达降低作用。此外,AS-IV能够通过激动M3受体显著减弱了4-DAMP对心肌细胞Lnc MIAT、p53 m RNA升高和mi R-708-5p的降低作用。结果表明AS-IV通过激动M3受体对小鼠心肌细胞缺氧后凋亡的保护作用与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53表达变化相关。3.AS-IV对给予M3受体抑制剂与mi R-708-5p mimic或mi R-708-5p inhibitor的HL-1细胞缺氧下p53表达、细胞凋亡率和凋亡蛋白的影响转染mi R-708-5p mimic能够显著降低给予AS-IV与4-DAMP缺氧心肌细胞下凋亡信号Bax、Caspase-3和p53蛋白和m RNA的表达,升高Bcl-2蛋白和m RNA的表达。结果提示mi R-708-5p mimic能够显著降低M3受体抑制剂4-DAMP对AS-IV心肌细胞凋亡保护作用的减弱。转染mi R-708-5p inhibitor能够显著增加给予AS-IV与4-DAMP缺氧心肌细胞凋亡信号Bax、Caspase-3和p53蛋白和m RNA的表达,降低Bcl-2蛋白和m RNA的表达。结果显示mi R-708-5p inhibitor能够显著增加M3受体抑制剂4-DAMP对AS-IV心肌细胞凋亡保护作用的减弱。研究结果提示,作为Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴承上启下的关键环节的mi R-708-5p,能够参与AS-IV激动M3受体对心肌细胞缺氧后凋亡的保护机制。小结:1.AS-IV通过激动M3受体抑制了HL-1心肌细胞缺氧与损伤。2.AS-IV可通过激动M3受体抑制缺氧后Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴介导的心肌细胞凋亡,从而发挥心肌保护作用。综上研究,本课题在构建小鼠心肌缺血模型基础上,通过AS-IV的体内实验研究,发现AS-IV能够减弱M3受体抑制剂对小鼠缺血心肌细胞损伤的加重和凋亡的促进作用。其抑制凋亡作用与调控Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53变化相关。为探讨Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴参与调控缺氧心肌细胞凋亡的机制,课题组通过运用生物信息学分析、FISH荧光共定位、双荧光酶素基因报告实验和细胞转染等技术,证明了Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴性关系和对凋亡的调控作用。最后,为验证AS-IV激动M3受体通过轴性关系影响缺氧心肌细胞的凋亡,课题组通过在HL-1心肌细胞缺氧模型中,体外转染mi R-708-5p高表达或低表达,验证了AS-IV具有通过M3受体抑制缺氧后Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴介导的心肌细胞凋亡的作用。至此,得出全文结论如下:1.抑制M3受体能够加重小鼠心肌缺血后心肌损伤与凋亡;AS-IV可激动M3受体降低小鼠的心肌缺血面积,抑制小鼠心肌缺氧损伤和凋亡,改善心功能,其作用与Lnc MIAT、mi R-708-5p和p53变化密切相关。2.M3受体能够调控HL-1心肌细胞的缺氧程度,并通过Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴调控缺氧后心肌细胞的凋亡。3.AS-IV可激动M3受体改善HL-1心肌细胞缺氧损伤,通过调控缺氧后Lnc MIAT/mi R-708-5p/p53轴抑制心肌细胞凋亡过程,发挥心肌保护作用。